胡兢晶 王波 苏海浩 丁俊彩 郭媛媛 谢斌华 伍苑宾 蔡丽君 郭梦杰

511442 广州，广东省妇幼保健院儿科

·论著·

应用外部引导序列切割人巨细胞病毒UL148 RNA的研究

胡兢晶 王波 苏海浩 丁俊彩 郭媛媛 谢斌华 伍苑宾 蔡丽君 郭梦杰

511442 广州，广东省妇幼保健院儿科

目的 研究人巨细胞病毒(Human cytomegalovirus, HCMV)临床病毒株UL/b′区域UL148基因功能及抗HCMV治疗新策略，应用DNA性质外部引导序列(External guide sequences，EGS)在体外抑制UL148 RNA的表达。 方法 应用RNA structure生物软件模拟UL148 RNA二级结构，选择二级结构相对简单的区域设计EGS，并合成EGS核苷酸序列。应用PCR方法分别扩增UL148及M1RNA基因，克隆至T7启动子下游，在T7 RNA聚合酶的作用下，体外转录UL148 RNA及M1RNA，其中UL148以32P标记并进行体外转录。混合EGS、M1RNA及UL148 RNA于切割反应液中，反应1 h后，进行尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，Typhoon扫描仪观察结果。 结果 根据UL148 RNA二级结构选取第58～72位碱基作为EGS结合区域，其切割位点位于57位，针对此区域设计EGS57，并在体外进行EGS57与UL148 RNA结合的二级结构的模拟，可形成M1RNA天然作用底物类似的茎环结构。在T7 RNA聚合酶的作用下，分别在体外转录M1RNA及UL148 RNA，其大小均与预期相符。经切割反应，可获得与预期切割位点相符的切割条带。 结论 EGS57可切割UL148 RNA，其切割位点准确，与预期相符。该研究为进一步探讨UL148基因功能提供有效基因沉默工具。

Fund programs: National Natural Science Foundation of China (81070516)；Natural Science Foundation of Guangdong Province of China (2015A030313726,9151008901000085)；Medical Scientific Research Foundation of Guangdong Province(A2015133,A2009078)

人巨细胞病毒(Human cytomegalovirus, HCMV)是一种β疱疹病毒，其基因组庞大。在人群中感染普遍，大多数人为潜伏感染或无症状感染，多数人在HCMV感染后可获得免疫[1, 2]。HCMV感染与心血管疾病及肿瘤的发生相关[3, 4]。

目前HCMV的致病机理尚不明确，Cha等[5]在1996年的研究中发现HCMV临床病毒株Toledo存在一个独特的UL/b′基因结构区域，该区域包括UL133～UL151在内的至少19个开放阅读框(Open reading frame, ORF)，在实验室株的反复传代过程中该区域的基因逐渐丢失，随着该区域基因的丢失病毒也丧失了毒力，推测该区域与HCMV的致病密切相关。研究已证实该区域的多个基因在HCMV感染过程中发挥重要作用，其中UL141和UL142编码产物通过调节细胞受体的表达来逃避NK细胞的识别和杀伤[6, 7]；UL144基因编码的蛋白与肿瘤坏死因子超家族成员结合，参与病毒的免疫逃避[8, 9]。

外部引导序列(External guide sequences，EGS)技术利用RNase P(原核生物来源的RNase P催化核心为377个核苷酸的M1RNA)对底物二级结构的识别，而非序列特异性，人工设计小分子核酸序列EGS与靶mRNA互补，并与mRNA特异性结合后，模拟tRNA的双链茎-环结构，使M1RNA识别，并不可逆的切割靶mRNA，在mRNA水平沉默基因的表达[10]。

本研究在前期的基础上[11]，应用EGS基因沉默技术，设计以HCMV UL148特定位点为靶目标的EGS小分子核酸工具，特异性切割UL148基因表达，以期为研究UL148基因功能及抗HCMV治疗奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料 Ex Taq聚合酶、核酸内切酶、T4 DNA 连接酶、T7 RNA polymerase、RNase抑制剂、RNase-free DNase I、质粒抽提试剂盒、PCR产物纯化试剂盒、琼脂糖回收试剂盒均购买自大连宝生公司；牛血清白蛋白组分Ⅴ购自北京鼎国公司；α-32P-UTP购自北京福瑞公司。

含 HCMV临床病毒株(D2) UL148 基因的质粒 pMD148为本实验室构建并保存；载体质粒 pGEM-T-Easy 购自基因公司；载体质粒pUC18购自大连宝生公司；基因测序及寡核苷酸片段合成由北京英俊公司完成；同位素标记 RNA marker为本实验室制备。

1.2 UL148 RNA 制备 以pMD148为模板[10]，设计上游引物UL148-F：5′-AGCGGGCCCTGTTGCGCTTGCTGTTCACGCTC-3′及下游引物UL148-R：5′-AGCGAGCTCCTACCGACGCCGCGACACCAGGT-3′。扩增体系：模板1 μl、上下游引物各1 μl、dNTP 4 μl、Ex Taq聚合酶0.5 μl、10×Ex Taq Buffer 5 μl、加灭菌水至50 μl。反应条件：94℃ 3 min；94℃ 30 s、60℃ 30 s、72℃ 45 s，30个循环；72℃ 10 min。PCR产物纯化后，经ApaⅠ与SacⅠ酶切与相应酶切后的pGEM-T-Easy质粒连接，转化、筛选克隆成功的质粒测序。鉴定正确的重组质粒命名为pGEM148。

为提高体外切割效率及更好的暴露切割位点，体外转录UL148小片段作为靶基因。将构建成功的pGEM148重组质粒为模板，以UL148-A1(5′-TGTAATACGACTCACTATAGGGCGAATTGGGC-3′)和UL148-A2(5′-TCCACGATCCGGGAGAGCGTTTCTAG A-3′)为引物，扩增UL148基因小片段转录模板，扩增产物命名为UL148-A，其大小为500 bp。以32P-UTP标记，以UL148-A为模板，体外转录UL148-A RNA，反应条件及体系：2.5 mmol/L rNTP 10 μl、RNasin 1.5 μl、牛血清白蛋白 V(2.5 mg/ml) 2.5 μl、10×转录缓冲液5 μl、加灭菌水至50 μl，混合均匀后加入线性DNA模板 5 μl、32P-UTP 1 μl、T7 RNA聚合酶1 μl，37℃孵育 2～4 h。

1.3 M1RNA的制备 以Oli MF5′-CGAGAATTCTAATACGACTCACTATAGAAGCTGACCAGACAGTCGCCG-3′及Oli MR5′-ACTAAGCTTAGGTGAAACTGACCGATAAGCC-3′为引物，以大肠埃希菌基因组DNA为模板，扩增大肠埃希菌M1RNA基因，经EcoRⅠ和Hind Ⅲ酶切后与相应的酶切后的pUC18连接，测序鉴定正确的重组质粒经HindⅢ线性化后，制备成大肠埃希菌M1RNA转录模板，加入T7 RNA聚合酶，体外转录M1RNA，反应体系及条件同UL148-A体外转录。

1.4 EGS设计 根据EGS设计原则[14]及UL148基因序列特点，选取UL148基因的58～72位为EGS结合区域，设计与该区域结合的DNA性质EGS。它包括3′结合区序列、额外环、T茎环及5′结合区序列。EGS与UL148 RNA结合后形成类似于ptRNA的多变区域与T茎环结构，并在EGS的3′末端形成一个-CCA游离末端。

1.5 切割反应 将底物RNA与EGS混合放入80℃水浴5 min，在冰上稍放，加入与底物等浓度量的M1RNA，在切割缓冲液(pH7.5，100 mmol/L MgCl2，100 mmol/L NH4Cl，50 mmol/L Tris)中37℃反应1 h。以8% 7 mol/L尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，并使用Typhoon扫描仪观察结果。

2 结果

2.1 pGEM148质粒鉴定 UL148基因克隆入pGEM-T-EASY质粒后，将目的片段置于T7启动子下游。重组质粒经质粒直接电泳，PCR及双酶切验证，其PCR产物大小为951 bp，其条带均与预期大小相符，并经序列测定证实pGEM148重组质粒构建成功。

2.2 UL148小片段体外转录 以UL148-A1、UL148-A2为引物，以pGEM148重组质粒为模板扩增UL148-A小片段(图1A)，其PCR产物为UL148-A小片段体外转录模板，以32P-UTP标记，体外转录UL148-A RNA其条带大小为500 bp，结果与预期相符，成功在体外获得32P标记的UL148-A RNA(图1B)。

2.3 EGS设计 设计EGS57与UL148 RNA的58～72位结合。EGS57序列为： ATCATAGTCGTGCGGTCTCCGCGCGCAGGTTCAAATCCTGCGGCTAGCGCCA，其中CATAGTC为3′结合区序列，GGCTAGC为5′结合区序列，与UL148 RNA结合后形成和ptRNA极为类似的结构，使核酶P识别该结构并在UL148 RNA结合部位的5′端进行不可逆的切割。

2.4 M1RNA重组质粒鉴定与体外转录模板制备 重组质粒pUC-M1经质粒直接电泳、PCR及双酶切验证，结果显示重组质粒大小为3 063 bp(图2B)，PCR鉴定扩增产物为377 bp(图2A)，均与预期相符。最终经序列测定证实pUC-M1重组质粒构建成功。以自备RNA maker为参照，BindⅢ酶切线性化后的pUC-M1质粒作为模板，以32P-UTP标记，在T7 RNA聚合酶的作用下，以尿素变性聚丙烯酰胺凝胶分离，扫描后可见377 bp大小的清晰条带(图2C)，证实在体外成功获得核酶M1RNA。

2.5 细胞外切割 EGS57切割后产物与预期大小相符(图3)，证实EGS57可在准确位点切割目标基因UL148 RZHNA。

注：1：RNA marker，2：切割产物，3：底物UL148-A RNA图3 EGS57体外切割UL148-A RNA结果1: RNA marker，2: Cleavage product，3: UL148-A RNA substrateFig.3 Assay of EGS57 cleavage UL148-A RNA in vitro

3 讨论

HCMV是先天性感染最重要的病毒之一，可引起严重的后遗症，是移植失败及移植术后死亡的重要病因。目前药物治疗已有很大进展，但由于毒副作用在一定程度上限制了药物的应用。因此寻求一种有效控制HCMV感染的新策略尤为重要。

EGS是基于RNase P发展的一种基因沉默技术，RNase P是细胞自身的天然核酶，无明显的毒性。基于其自身技术特点，EGS作为基因治疗的一种小分子核酸药物，具有良好的前景，为抗HCMV治疗提供了一个新的手段和思路。

本研究选取DNA性质EGS在体外实验中显示出较好的切割效率。目前基于EGS技术的研究多为RNA性质，虽然其切割效率高，但合成成本高，易降解，不便于运输及保存，操作过程要求严格，在一定程度上限制了它的发展。目前DNA性质EGS研究较少，其切割效率较RNA性质EGS低，主要原因是它与mRNA亲和力较低，增加剂量可提高效率，但它本身成本低，易于合成、保存及运输，无明显细胞毒性[12, 13]，切割位点准确具有可选择性，是较为理想的基因沉默工具。

UL148基因位于UL/b′区域，其基因功能尚不明确。一项在恒河猴CMV的研究中发现：与HCMV UL148核酸序列高度同源的Rh159基因与恒河猴CMV的细胞嗜性相关[14]。目前有关人类HCMV UL148基因功能尚不明确，本课题组已对该基因进行了大量前期研究，在HCMV感染细胞中检测到该基因mRNA的表达，并且该基因存在RGD、蛋白激酶C等多个重要翻译后修饰位点，这些都高度提示HCMV UL148基因极有可能是重要的功能基因。本课题研究获得的特异性切割UL148基因的EGS57，为进一步研究UL148基因提供有效基因沉默工具，也为明确该基因功能奠定了基础。

[1] Sylwester A, Nambiar KZ, Caserta S, et al. A new perspective of the structural complexity of HCMV-specific T-cell responses [J].Mech Ageing Dev, 2016,158:14-22.doi: 10.1016/j.mad. 2016.03.002.

[2] Luo MH, Hannemann H, Kulkarni AS, et al. Human cytomegalovirus infection causes premature and abnormal differentiation of human neural progenitor cells[J]. J Virol, 2010,84(7):3528-3541. doi: 10.1128/JVI.02161-09.

[3] Wells R, Stensland L, Vieira J. The HCMV UL112-113 locus can activate the full KSHV lytic replication cycle[J]. J Virol, 2009, 83(9):4695-4699. doi: 10.1128/JVI.02241-08.

[4] Streblow DN, Dumortier J, Moses AV, et al. Mechanisms of cytomegalovirus-accelerated vascular disease: induction of paracrine factors that promote angiogenesis and wound healing[J]. Curr Top Microbiol Immunol, 2008,325:397-415.

[5] Cha TA, Tom E, Kemble GW, et al. Human Cytomegalovirus Clinical Isolates Carry at Least 19 Genes Not Found in Laboratory Strains[J]. J Virol, 1996,70(1):78-83.

[6] Wilkinson GW, Tomasec P, Stanton RJ, et al. Modulation of natural killer cells by human cytomegalovirus. [J] J Clin Virol,2008,41(3):206-212. doi: 10.1016/j.jcv. 2007.10.027.

[7] Wills MR, Ashiru O, Reeves MB, et al. Human cytomegalovirus encodes an MHC class I-like molecule (UL142) that functions to inhibit NK cell lysis[J]. J Immunol,2005,175(11):7457-7465.

[8] Poole E, Atkins E, Nakayama T, et al. NF-KAPPA B-mediated activation of the CCL22 chemokine by human cytomegalovirus UL144 gene product escapes regulation by viral IE86[J]. J Virol,2008,82(9):4250-4256. doi: 10.1128/JVI.02156-07.

[9] Poole E, King CA, Sinclair JH, et al. The UL144 gene product of human cytomegalovirus activates NF kappaB via a TRAF6-dependent mechanism[J]. EMBO J,2006,25(18):4390-4399.

[10] Kawa D, Wang J, Yuan Y, et al. Inhibition of viral gene expression by human ribonuclease P[J]. RNA,1998,4(11):1397-1406.

[11] 王波, 李月琴, 叶宁, 等. 临床低传代人巨细胞病毒株 UL148 开放阅读框mRNA的表达与鉴定[J]. 中华医学杂志,2008,24(88): 1693-1696.

[12] Ma M, Benimetskaya L, Lebedeva I, et al. Intracellular mRNA cleavage induced through activation of RNase P by nuclease-resistant external guide sequences[J]. Nat Biotechnol,2000,18(1):58-61. doi: 10.1038/71924.

[13] Zhu J, Trang P, Kim K, et al. Effective inhibition of Rta expression and lytic replication of Kaposi′s sarcoma-associated herpesvirus by human RNase P[J]. Proc Natl Acad Sci U S A,2004,101(24):9073-9078. doi: 10.1073/pnas.0403164101.

[14] Lilja AE, Chang WL, Barry PA, et al. Functional genetic analysis of rhesus cytomegalovirus: Rh01 is an epithelial cell tropism factor[J]. J Virol,2008,82(5):2170-2181. doi: 10.1128/JVI.02316-07.

(本文编辑：唐浏英)

Effective inhibition of human cytomegalovirus UL148 gene expression by external guide sequences in vitro

Hu Jingjing, Wang Bo, Su Haihao, Ding Juncai, Guo Yuanyuan, Xie Binhua, Wu Yuanbin, Cai Lijun, Guo Mengjie

Department of Pediatrics, Guangdong Provincial Maternal and Child Health Hospital, Guangzhou 511442, China

Wang Bo, Email: dr.wangbo@163.com

Objective To investigate the UL148 gene function of human cytomegalovirus (HCMV) low passage clinic isolate and new strategies for anti-HCMV treatment, the DNA-based external guide sequences (EGSs) were designed to inhibit UL148 RNA expression. Methods UL148 RNA secondary structure was analyzed by RNA structure technique, an appropriate region was chosen for DNA-based EGS57 synthesis, targeted the UL148 RNA. The M1RNA and UL148 RNA were generated by PCR for transcription in vitro. The UL148 RNA and M1RNA were transcribed in vitro under the function of T7 RNA polymerase. The UL148 was labelled by32P. The cleavage reactions were carried out by mixing up EGS, M1RNA with UL148 RNA for 1 h. The products were separated by urea denaturing polyacrylamide gel electrophoresis and detected with Typhoon Phosphor Imager. Results UL148 RNA ranged from 58 to 72 sites was the binding position, and 57 was a cleavage site. EGS57 was designed and synthesized. EGS57 was combined with UL148 RNA to form the natural substrate of M1RNA. UL148 RNA and M1RNA were synthesized through T7 RNA polymerase catalyzing, and the products were conformed. After cleaving reactions, DNA-based EGS57 was shown to be able to cleave UL148 RNA efficiently in vitro by a complex with M1RNA. ConclusionsUL148 RNA was cleaved efficiently by EGS57, and the cleaving site was conformed as expectation. It will provide the gene silent tool effectively for further study the function of UL148 gene.

Human cytomegalovirus; External guide sequences; UL148; Clinic isolate

王波，Email: dr.wangbo@163.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2017.03.001

人巨细胞病毒；外部引导序列；UL148；临床病毒株

国家自然科学基金(81070516)；广东省自然科学基金(2015A030313726，9151008901000085)；广东省医学科研基金(A2015133，A2009078)

2016-03-17)