姬承东，李剑峰

(1.湖南高尔夫旅游职业学院，湖南 常德 415900； 2.贵州师范学院，贵州 贵阳 550018)

高尔夫草坪蘑菇圈真菌拮抗木霉菌株的筛选及其抑菌作用

姬承东1，李剑峰2

(1.湖南高尔夫旅游职业学院，湖南 常德 415900； 2.贵州师范学院，贵州 贵阳 550018)

草坪蘑菇圈是一种在高尔夫草坪上普遍发生的严重病害，经常造成草坪草的严重衰退甚至死亡。木霉 (Trichoderma)菌对蘑菇圈真菌有良好的抑制作用。从贵阳乐湾国际高尔夫球场草坪出现的蘑菇子实体中分离出当地有代表性的真菌菌株1506，经形态学鉴定为环柄菇属菌株(Lepiotaspp.)。并从曾发生过蘑菇圈病害，但第2年未发生蘑菇圈的草坪土壤中分离和筛选出典型拮抗木霉菌8株，其中加纳木霉GCPL175(Trichodermaghanense)和木霉菌株GGFL12(Trichoderma.sp.)的抑菌能力最强，其发酵液的无菌滤液对1506抑菌率分别达到61.23%，73.13%，显著高出其他菌株95.75%，1178.50%(P<0.05)，但供试木霉菌株的几丁质酶活性与其对环柄菇属菌株1506的抑菌率无明显相关。

高尔夫草坪；蘑菇圈病害；拮抗真菌；抑菌能力；木霉

草坪蘑菇圈是一种在高尔夫草坪上普遍发生的病害，造成草坪草衰退甚至死亡[1]，属于高尔夫草坪养护中的难点问题。现多以化学药物熏蒸或喷施来防治[2]，效果显著但长期大量使用存在一定环境安全风险。目前尚缺乏针对高尔夫球场草坪蘑菇圈的专用生防菌剂。木霉属(Trichoderma)菌株是目前真菌病害和细菌病害应用较多的生防菌种，郎八一等[3]通过筛选，获得对小麦全蚀、番茄早疫、稻疫等真菌病原具有拮抗活性的木霉菌株。张海军等[4]发现，绿色木霉GY20对棉花枯萎病病原真菌具有良好的抑菌活性。近年来有研究指出，木霉菌能夺取或阻断平菇菌丝体所需的养分，并释放专性毒素抑制或破坏病原菌丝及子实体的形成[5]，而董昌金等[6]也指出，木霉对香菇菌丝体有相似的作用。以上研究预示着木霉菌株对草坪蘑菇圈可能会产生防效，并产生高活性纤维素酶快速降解表层植物残渣，减少草坪病害发生，提高草坪草抗病性。而利用木霉进行草坪蘑菇圈的防治与化学药物防治相比，有价格低廉用量少，防效长、无污染、防治兼备的优点，有巨大的应用潜力和经济效益。以引起草坪蘑菇圈病害的环柄菇属菌为防抑对象，对多株木霉菌株进行抑菌圈试验和生长对峙试验，为草坪蘑菇圈病害专用生物菌剂的研究提供菌种资源和参考依据。

1 材料和方法

1.1 病原菌的分离

2014年7～8月，于贵州省贵阳市乌当区东南部的乐湾国际高尔夫球场草坪选取5处形态相似的典型蘑菇圈样地进行标记。采样地位于贵州省贵阳市乌当区东南部，地理位置N 25°59′32″，E 109°04′09″，该区域平均海拔1 242 m，属亚热带季风湿润气候，并有明显的高原性气候的特点。年平均降水量1 180～1 271 mm，年均温15℃。在所需采样地上采集蘑菇子实体，分离出代表性供试蘑菇圈真菌1506，经贵州师范学院食用真菌实验室鉴定为环柄菇属菌Lepiotasp.，菌株在实验室-80℃超低温冰箱保存。

1.2 培养基的配制

孟加拉红培养基参照刘政等[7]的方法配制，蛋白胨5 g，葡萄糖10 g，磷素二氢钾1 g，琼脂15 g，硫酸锰0.5 g，1/300的孟加拉红10 mL，蒸馏水1 000 mL，调节pH为 7.0。取氯霉素0.1 g，用0.22 μm膜单独过滤灭菌后添加。

PDA琼脂平板培养基参照刘紫英等[8]的方法配制，葡萄糖20 g，马铃薯200 g，琼脂15 g，蒸馏水1 000 mL。

1.3 土壤木霉菌株的分离及拮抗菌株的筛选

于2015年8月，在标记原蘑菇圈发生地选择未再次发生蘑菇圈的样地采集土壤样品。采集前揭起并移除草皮，去除杂物后挖取0～15 cm的土壤剖面，分别取0～5、5～10、和10～15 cm土层土样，去除植物残体过筛后，将每层土壤充分混合，将土壤装入无菌铝盒内带回实验室，于8 h内以平板稀释法分离真菌菌株。

取土壤样品1 g置入装有50 mL无菌水的无菌锥形瓶，以漩涡振荡器混匀3 min，配制10-1～10-5的系列梯度浓度土壤稀释液。取各稀释度溶液0.2 mL均匀涂抹到9 cm孟加拉红培养平板上，25℃恒温培养48～96 h,期间观察菌落生长状况。选取类似木霉菌株的单菌落在PDA培养基上进行纯化。纯化后在100倍显微镜下观察菌丝和产孢形态并拍照，根据真菌鉴定手册[9]并参考《木霉分类与鉴定》[10]进行鉴定。

木霉菌株与蘑菇圈真菌1506的平板对峙培养：参照吴晓金等[11]和张海军等[14]的方法，将初筛木霉菌株接种PDA琼脂平板28℃活化培养。同时将供试的蘑菇圈真菌1506接入空白 PDA琼脂平板，28℃培养48 h后，以4 mm直径的无菌打孔器在长满木霉的平板上取下5 mm直径的菌饼，将菌饼放置于培养皿中距菌落5 cm处，28℃培养并持续观察菌落及菌丝体生长状况，每处理3次重复。以对真菌菌落的生长有明显抑制能力的菌株为拮抗菌株。

1.4 木霉发酵液对蘑菇圈真菌1506菌落生长的抑制作用

参照吴晓金等[11]的方法，将木霉菌株接入PDA液体培养基，控温摇床内28℃，120 r/min培养5 d后，在无菌台先以0.45 μm无菌滤布过滤，再在无菌0.22 μm过滤器过滤。滤液与灭菌后尚未凝固的双倍浓度PDA固体培养基等体积混合，在9 cm平皿中制成琼脂平板，对照以无菌水代替滤液。待凝固后立即在平板中心接入5 mm直径的1506菌饼，每处理3次重复，生化培养箱28℃培养，2 d后测定1506菌株对照组的菌落直径D和处理组菌落直径d。

抑菌率=(D-d)/(D-5)×100%

式中：D为对照菌落直径；d为处理组菌落直径；5为菌饼直径。

1.5 木霉菌株挥发性物质对蘑菇圈真菌1506菌落生长的抑制作用

参照吴小平等[11]的方法，将各待测木霉菌株与蘑菇圈真菌1506分别点接在不同9 cm PDA平板上，28℃避光培养6 h。在超净工作台内取下平皿盖，将接有木霉菌株和1506菌株的平皿开口对扣，以石蜡封口膜对边缘进行密封，以确保木霉挥发性物质无泄露，以空白PDA代替接有木霉菌株的平皿作为对照，根据蘑菇圈真菌1506的菌落大小比较木霉菌的抑菌能力，每处理3次重复。

1.6 木霉几丁质酶活力的测定

几丁质酶测定液体培养基参照关丽杰等[12]的方法配制：磷酸二氢钾1 g，氯化钙0.2 g，2%几丁质胶体100 mL，蒸馏水1 000 mL，调节pH为5.6±0.1。

将待测木霉菌株接入培养基，120 r/min，28℃避光培养10 d后参照吴晓金等[11]的方法，以水杨酸分光光度法(DNS法)测定菌株发酵液中的几丁质酶活力。在10 mL离心管中添加木霉发酵液2 mL，3 000 r/min离心5 min，取上清液0.3 mL与同体积2%的几丁质胶体，40℃恒温水浴1 h；加入0.3 mL DNS沸水浴10 min，(以预先沸水浴20 min的木霉发酵液作为酶失活对照),再加入3 mL 无菌蒸馏水，振荡后4 000 r/min离心10 min，取上清液1 mL测定D540 nm。

1.7 数据分析

采用Excel软件进行数据整理，用SPSS16.0软件进行数据分析(Duncan法，P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 高尔夫草坪蘑菇圈发生地土壤中的拮抗木霉菌株

从曾发生过蘑菇圈，但次年无蘑菇圈形成的高尔夫草坪土壤中分离出大量真菌，其中木霉属(Trichodermasp.)菌18株，占总真菌的26.7%。通过生长对峙试验发现，其中44.4%的木霉菌株，对病原菌Lepiotasp.1506有明显的侵染能力，木霉菌丝到达的区域，病原菌菌丝体不再生长，形成明显的对峙线。而木霉菌丝与病原菌株相接后，病原菌的菌丝体由灰白色逐渐转为黄褐色，颜色逐步加深，并在3～7 d枯萎死亡。进一步通过菌落形态的显微镜观察，发现对病原菌丝体有缠绕和溶解作用，其中筛选出的代表性菌株为GCPL175(T.atroviride)、GCPL29(T.atroviride)、GCEL122(T.atroviride)、GCPN05(T.piluliferum)和GGFL103(T.polysporumv)、GGFL12(T.polysporum)、GGFL14(T.deliquescens)和GGCL08(T.deliquescens)等，其菌株名称及形态特征见表1。研究表明，在发生过蘑菇圈病害，但次年再未出现的蘑菇圈中存在大量能够抑制和拮抗病原菌的木霉菌株，这些菌株一方面可能来源于土壤本身，因病原菌的大量繁殖而获得养分，重寄生于蘑菇圈真菌并大量繁殖，使病原菌处于被压制和拮抗下，从而使蘑菇圈在次年不能发生。

表1 蘑菇圈发生地土壤中的代表性木霉菌株Table 1 Trichoderma strains isolated from soil in fairy ring

2.2 木霉菌代谢物对环柄菇属菌株1506的抑制作用

不同木霉菌株的发酵代谢物对环柄菇菌1506的菌落生长均有抑制，但菌株间差异较大。其中GCPL175和GGFL12的代谢物对1506的抑菌率高达61.23%和73.13%(表2)。其中GGFL12对1506的抑菌率分别显著高出GCEL122和GGCL08菌株1.635和11.78倍，差异显著(P<0.05)。供试菌株中GGCL08对病原菌的抑制能力最弱，仅为GGFL12的7.82%，差异显著(P<0.05)。表明即使没有活体菌丝的存在，经过滤灭菌的木霉代谢物对蘑菇圈真菌同样有良好的抑制效果。

表2 不同木霉菌株发酵代谢物对蘑菇圈真菌 1506菌落的抑制作用Table 2 Inhibition effect of metabolites from differentTrichoderma strains on mushroom strain 1506

注：所有数据为平均值±标准误，同列不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05)，下同

2.3 不同木霉菌株的挥发物对蘑菇圈真菌1506菌落生长的影响

木霉菌株GCPL175和GGFL12的挥发性物质对环柄菇菌1506的抑制作用最强，抑菌率分别为29.87%，22.51%，差异显著(P<0.05)。GCEL122和GGCL08菌株的抑菌作用较弱，抑菌率仅为4.76%～2.59%，与对照并无显著差异(表3)。这一结果与不同木霉菌发酵代谢物对病原菌的抑制能力差异相似，表明挥发物质的抑菌能力可作为木霉菌株抑制蘑菇圈真菌效果的速测指标之一。但同时也发现，木霉挥发物质对病原的抑制能力均显著弱于发酵代谢物(P<0.05)，这可能与挥发性物质由木霉菌落扩散到病原菌菌落过程中的浓度衰减有关，也可能是由于除挥发性物质外，还有其他产物对蘑菇圈真菌有抑制作用，具体原因有待进一步分析。

表3 不同木霉菌株挥发物质对环柄菇菌 1506的抑菌能力Table 3 Inhibition effect of volatiles from differentTrichoderma strains on mushroom strain 1506

2.4 不同木霉菌株的几丁质酶活性

从发生过蘑菇圈的草坪土壤中分离出的木霉菌株间几丁质酶活性差异较大，在发酵10 d时，GCPL175的几丁质酶活性最高，显著高出其他菌株60.8%～186.9%(P<0.05)。活性最低的为GGCL12，仅为其他菌株的24.1%～69.2%(P<0.05)。而GCEL122和GGCL08的几丁质酶活性均为中等(图1)。通过对比表2和3可见，木霉菌株10 d时的几丁质酶活性与木霉对1506的抑制能力无明显相关。

图1 不同木霉菌株的几丁质酶活性Fig.1 Chitinase activity of tested Trichoderma strains on 10th day

3 讨论与结论

1)研究发现，曾发生过蘑菇圈，但次年无蘑菇圈形成的高尔夫草坪样地的土壤中存在大量能够抑制和拮抗病原菌的木霉属菌株。这类菌株包括深绿木霉(Trichodermaatroviride)，洋大戟木霉(Trichodermapiluliferum)，多胞木霉(Trichodermapolysporum)和绿木霉(Trichodermadeliquescens)共8株代表性菌株，其中GCPL175(Trichoderma.atroviride)和GGFL12(Trichodermapolysporum)对病原菌的拮抗能力最强，具有良好的应用价值。吴晓金等[11]和陈凯[13]等指出，从食用菌病害中分离出的木霉菌可用于代替农药防治植物病原真菌。而此次研究中分离出的木霉菌株则意味着可用于防治草坪蘑菇圈病害。这些木霉菌株一方面可能来源于土壤本身，因病原菌的大量繁殖而获得养分，重寄生于病原菌并大量繁殖形成优势群落，使病原菌处于被压制和拮抗下，从而使蘑菇圈在次年不能发生，其中的生物学原理和发生过程可作为草坪蘑菇圈病害研究的方向，值得深入探讨。而从曾发生过蘑菇圈，但次年无蘑菇圈重复发作的草坪样地土壤中获取蘑菇圈病害拮抗菌株也将是一个成功率较高的拮抗菌获得途径。

2)研究也发现，木霉菌株对蘑菇圈真菌1506的抑制作用首先表现为木霉菌丝体对菌丝体的缠绕、溶解，这与吴小平[14]等的研究结果一致。其次是其发酵代谢物和挥发性物质对病原菌的抑制，其中几丁质酶是木霉分泌的用于降解病原菌细胞壁的胞外水解酶，通常被认为能拮抗或抑制其他真菌[13]。研究中菌株的几丁质酶活性与其抑菌能力间并未发现有明显的对应关系，这与杨合同等[15]和吴晓金等[11]的结果一致，即木霉对食用菌或其他真菌的侵染能力与木霉几丁质酶活性间没有数量上的相关性。吴小平等[11]的研究结果也指出，几丁质酶活性与木霉对食用菌的抑制作用并无必然联系。这一方面说明几丁质酶的活性测定在筛选抑制蘑菇圈真菌木霉菌株的过程中可能不具有代表性，另一方面也表明木霉对蘑菇圈病害的抑制可能是一个多机制共同作用的结果，其具体机制还有待深入研究探讨。

3)除发现木霉菌活体对蘑菇圈真菌的直接抑制外，研究也证实即使没有活体菌丝的存在，木霉代谢物同样对蘑菇圈真菌有良好的抑制作用，这预示木霉发酵也具有较高的抑菌活性，而经过滤的木霉活体的滤液对环境和土壤更加安全，具有良好的开发前景，但如何长期保持其抑菌活性将作为重要的环节进行考虑。

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Isolation and screening of antagonisticTrichodermastrains against fairy ring on golf turf

JI Cheng-dong1,LI Jian-feng2

(1.HunanGolfandTourismCollege，Changde415900,China； 2.GuizhouNormalCollege,Guiyang550018,China)

The fairy ring widely occurs in golf turf and causes turfgrass degradation or even death.Fungi fromTrichodermaperform the promising effect on the control of fairy ring.In this study,8 typicalTrichodermastrains were isolated from the fairy ring occurred turf soil to control the pathogenic bacteriaLepiotaspp.1506 from sporophore of mushroom in Happy Valley International Golf Club (Guiyang).The result indicated that 2 strains (Trichodermaghanense,GCP L175 andTrichodermasp.,GGFL 12) performed the best and the inhibition rate reached 61.23% and 73.49% respectively,which were significantly higher than the other strains(P<0.05).The activity of chitinase inTrichodermastrains did not show relationship with inhibition rate toLepiotaspp.1506.

golf turf；fairy ring；antagonistic fungi；mycostatic activity；Trichoderma

2017-04-07；

2017-05-03

奥林高尔夫教育与研究基金(AL2015001)资助

姬承东(1979-)，男，甘肃金昌人，讲师，硕士，研究方向为高尔夫球场草坪养护管理。 E-mail：jichengdong@126.com 李剑峰为通讯作者。

S 688.4

A

1009-5500(2017)03-0081-05