张利平

（浙江省柑橘研究所 台州黄岩318026）

几丁质酶及其在农业生产中的应用

张利平

（浙江省柑橘研究所 台州黄岩318026）

几丁质酶是一种具有生物催化活性的水解酶，它具有水解几丁质的特异功能，可以将几丁质水解成几丁糖或者N-乙酰葡萄糖胺。几丁质酶在农业上主要是防治害虫，几丁质酶可以直接作为杀虫剂或者和其他微生物协同防治害虫，几丁质酶基因转入植物中，可以增强植物的抗病性。

1 几丁质

几丁质又称甲壳素或甲壳质,学名为( 1-4)- 2-乙酰胺基- 2-脱氧- β-D葡聚糖,它是由葡萄糖结构单元组成的直链多糖,也是唯一含氨基的均态多糖,结构与纤维素非常相似。几丁质是广泛分布于自然界的生物多聚物,自然界每年生成的几丁质约有一百亿吨,在天然聚合物中几丁质的贮量占第二位,仅次于纤维素。几丁质是构成大多数真菌细胞壁的主要成分,同时也大量存在于昆虫和动物的甲壳中[1]。

2 几丁质酶

几丁质酶是一种具有生物催化活性的水解酶，它能特异性地水解几丁质。内切几丁质酶可以从内部随机打断几丁质，产生可溶的、小分子量的几丁四糖、几丁三糖和几丁二糖产物。外切几丁质酶从几丁质的非还原末端降解几丁质，产物为N-乙酰葡萄糖胺。根据其来源不同可以将其分为几类，即微生物几丁质酶，植物几丁质酶，昆虫几丁质酶等。

2.1 几丁质酶特性

微生物几丁质酶的分子大小差异很大，一般为10～100 kD，但因其来源不同,差异也很大。目前研究的相对分子质量最大的是Microbulbifer degradans 2～40株的几丁质酶,达到了140kD。粘质沙雷氏菌(S.marcescens)产生五种几丁质酶,其分子量分别为21、36、48、52和57kD,而从拟橄榄绿链霉菌(S.olivaceoviridis)的培养液中纯化得到的五种几丁质酶其分子量分别为20.5、30、47、70和92kD,皱褶链霉菌(S.plicatus)产生的二种几丁质酶分子量分别为49、63kD,红色链霉菌(S.erythraeus)则仅产生一种,分子量为30kD。微生物几丁质酶反应的最适pH值的变动范围很大，一般认为是 3～11，但绝大多数微生物几丁质酶最适pH值为4.0～ 6.0的偏酸性环境。酶在pH值为3～11时通常都十分稳定，酶的等电点pI为3.6～ 8.6。微生物几丁质酶往往对热都比较稳定，在 4～60℃时都具有酶活性，而像激烈热球菌的几丁质酶在98～100℃时仍然能正常进行水解反应，但大多数微生物几丁质酶的最适反应温度为40～50℃，在-20℃保存 9年仍有酶活性。微生物几丁质酶的这种热稳定性特点，使其在生物技术产业方面具有巨大的应用潜力[2]。

植物几丁质酶大部分是小分子蛋白，分子量介于12～55kD之间。在以几丁质为底物时，最适pH一般低于7，其等电点pI介于3～10之间，对热稳定（有的酶在60℃仍很稳定），抗蛋白酶。植物几丁质酶的等电点有的偏酸,有的偏碱,常称为酸性或碱性几丁质酶。植物体内通常含有一种或几种几丁质酶,有些植物既含酸性几丁质酶,又含碱性几丁质酶[3]。

昆虫几丁质酶的分子量在45～85kD之间，酶的活性范围在pH 4.0～ 8.0之间，等电点在 5.0～ 7.0之间，大多属于18家族几丁质酶。昆虫几丁质酶属于内切酶，可将几丁质水解为低分子量的乙酰氨基葡萄糖的寡聚物，如几丁四糖、几丁三糖、几丁二糖[4]。

2.2 结构特征

典型的几丁质酶由N端信号区、催化区和C端延伸区组成，有的还有几丁质结合域。各功能域具有各自的功能。

研究表明，多数微生物几丁质酶的基因以单拷贝形式存在，包括启动子、SD序列、结构基因和终止子，这与原核生物的基因结构相似。在相应的酶蛋白结构上有对应的结构域，从 N端到 C端依次为信号肽、几丁质催化区、几丁质结合区以及一个短的 C端区。

近些年来，对多种植物的几丁质酶基因进行了克隆。核苷酸和氨基酸的序列分析表明，植物几丁质酶前体一般都含有一个 N端信号区、一个主结构区（催化区）和C端延伸区，有的在 N端信号区之后有富含半胱氨酸的CBD，它与主结构区之间有一段可变交联区。

无脊椎动物几丁质酶的结构特征一般包括了催化域、富含Cys的几丁质结合域(CBD)区、富含Ser/Thr区(该区一般糖基化)。昆虫几丁质酶通常在 N端有一个催化区，在 C端有一个几丁质结合域(CBD)。但也有例外,如Penaeus japonica的 几丁质酶在 N端有一个CBD,Caenorhaditis elegans几丁质酶在 C端有两个CBD等[5]。

3 几丁质酶在农业上的应用

几丁质酶在农业上的应用主要表现在防治害虫上。几丁质酶可以直接防治害虫或者与其他微生物协同防治，几丁质酶基因转入到植物中，增加植物对害虫的抗病性，达到防治的作用。

3.1 几丁质酶防治害虫

几丁质酶可以作为杀虫剂直接防治害虫。几丁质是昆虫外表皮（外骨骼）、呼吸道、肠腔（包括围食膜）和生殖系统的结构组成，并且是外骨骼和围食膜的主要组成成分，通常占昆虫体壁干重的25%～40%，而昆虫变态发育的每一次蜕皮都要完成几丁质的更新，也就是消化旧皮层几丁质的同时合成新皮层的几丁质，这一过程主要依赖于自身分泌的几丁质酶起作用。另外，昆虫的围食膜和外骨架是昆虫抵御病原体重要生理屏障，而昆虫病原真菌可利用自身的几丁质水解酶和蛋白水解酶突破这种屏障，几丁质是昆虫杀虫剂作用的一个极具吸引力的潜在靶目标，通过将几丁质酶导入昆虫体内来破坏其正常的组织结构，达到抑杀害虫的目的。

3.2 转基因植株表达几丁质酶

植物受病原菌侵染后会产生一系列的主动防御反应,这些反应包括:植保素的合成;植物细胞壁结构的增强;蛋白酶抑制剂及一些水解蛋白的诱导和积累。水解蛋白中研究较多的是几丁质酶。很多植物病原真菌细胞壁的主要成分是几丁质,体外抑菌试验表明,几丁质酶能抑制一些病原真菌的孢子萌发和菌丝生长。因此,几丁质酶一直被看作是植物抗真菌病害的潜在物质。现在已经克隆到了许多几丁质酶基因，这些几丁质酶基因被转到植物中增强植物对病虫害的抵抗力。

20世纪80年代以来,科学家已分别将细菌及植物几丁质酶基因转移到烟草、番茄、大豆、马铃薯、葛首、葡萄及甜菜等植物中,获得了表达几丁质酶活性的转基因植物。与普通植物相比,转基因植物不仅抗真菌,而且对线虫和昆虫也有一定的抗性。

1996年，Grison等将组成型表达的几丁质酶基因导入甘兰型油菜中,利用三种病原菌Cylin drosporium concentricum(柱胞霉菌)、Phomalingam（茎点霉菌）、Sclerotinia sclerotiorum（ 菌核菌）做接种实验,结果表明,转基因植株对病害的田间耐性比对照明显增强。Lorito等将从Trichoderma harzianum而来的编码一个强的抗真菌的几丁质内切酶导入烟草和土豆中,获得了对Alterbaria alternata、A.solani有很高抵抗力的植株。

通过向植物中导入外源几丁质酶基因,使其在植物体中过量表达,提高植物体对真菌病害的抗性,几丁质酶基因工程为防治植物真菌病害开辟了一条新途径,而且在生产试验中显示出其优越性。随着对几丁质酶的催化机制、抗病机理,以及几丁质酶基因的克隆测序等研究的不断深入,形成了它的新的应用策略。但在实际应用中,还存在一些问题,应用于病害防治还需要一些时间。

3.3 几丁质酶和微生物的协同作用

几丁质酶与微生物杀虫剂之间有增效作用。以几丁质酶作为辅剂与Bt剂一起施用可以提高Bt菌的杀虫效果。Brandt等(1978)发现几丁质酶可在昆虫围食膜上造成穿孔而有利于病原微生物进入昆虫组织。Smirnoff等研究发现几丁质酶与苏云芽孢杆菌一起防治云杉色卷娥能增强Bt的杀虫效果。Arora等(2003)报道，几丁质酶Chi36的加入使得Bt对斜纹夜蛾幼虫的半致死浓度降低了30%。刘艳荷(2008)、王芳(2004)等的研究证实杆状病毒几丁质酶基因的表达产物对昆虫病毒早期侵染和苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)都有明显的增效作用，Shapiro等人发现几丁质酶能显著增强LDNPV对舞毒娥的致死作用。Dubois等人研究发现几丁质酶在体外亦能从3～ 4龄舞毒娥幼虫中观察到围食膜穿孔。用包裹几丁质酶制剂的饲料喂健康的舞毒娥幼虫，也同样发现其围食膜穿孔[3]。

[ 1]黄崇元.甲壳素资源的综合利用与发展[J].湿法冶金,1995,( 9):4～15.

[ 2]王治伟,刘志敏.微生物几丁质酶研究进展.生物技术通讯[J].2006,( 3):439～442

[ 3]欧阳石文,赵开军,冯兰香.植物几丁质酶的结构与功能、分类及进化[J].植物学通报,2001, 18( 4)：418～426

[ 4]李瑶,范晓军.昆虫几丁质酶及其在害虫防治中的应用[J].应用昆虫学报,2011,48( 5): 1489～1494

[ 5]吴志刚,朱旭芬.几丁质酶的分子生物学特性及其在转基因植物中的应用[J].生命科学,2002, 14( 2):117～121

2012-12-03