曹赋

轻症和重症H7N9禽流感病毒的致病性研究

曹赋

目的对轻症和重症H7N9禽流感病毒菌株的致病性进行分析，并探讨病毒分子特征与其致病差异间的关联性。方法通过建立三种模型即PBMC人体外培养及病毒感染，人肺组织体外培养及病毒感染及小鼠感染H7N9动物模型，分别对轻症和重症H7N9携带病毒感染者其分离株包括GD-6和GD-7，对两株病毒的感染性及病理情况进行研究分析。结果病毒对三种模型组织均能感染并进行有效复制但复制GD-7的能力高于GD-6；在小鼠肺组织内，其重症分离株GD-7病毒增殖力较轻症分离株GD-6要高且对于小鼠的致病力其重症分离株GD-7较轻症分离株GD-6强。结论GD-7作为重症分离菌株其复制能力及致病能力均较GD-6轻症分离株要强。

轻症；重症；H7N9禽流感病毒；致病性

禽流感作为由甲型流感病毒所引发导致的一类禽类传染性疾病，而人感染H7N9禽流感主要是由禽流感病毒中的H7N9亚型禽流感病毒所致的一种急性呼吸道传染病[1-2]。其起病急聚、进展速度快、病情恶化后造成的后果较为严重，受到大家的倍加关注。若为重症患者甚至可发生肺炎合并呼吸衰竭症或致其他功能器官衰竭的症状，存在较高的病死率[3]。

在H7N9流行患者中，临床上可主要表现出轻症和重症两种类型的感染携带者。而轻症患者中主要发病人群为儿童，临床中主要以流感样症状如发热、咳嗽、咽部充血作为特征。而重症患者中的发病人群主要面向较大年龄的成人，病情发展急聚，且极易发生重症肺炎及急性呼吸窘迫综合征（ARDS），甚至严重者可发展致感染性休克，多功能器官衰竭至死亡[4-5]。因此本文通过对轻症和重症H7N9禽流感病毒携带者的致病性进行相关研究，对其临床治疗提供积极的指导意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料

所取到的毒株、细胞及H7N9组织禽流感病毒从轻症并已愈患者中进行分离GD-6，H7N9禽流感病毒从已重症死亡病例中将GD-7进行分离，两株病毒菌株均由CDC测试机构予以惠赠。而人外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cell，PBMC）经Ficoll-Hypaque梯度离心从人的全血中进行一一分离。取自新鲜的人肺组织从癌变组织远处的正常肺组织及癌旁组织中进行提取的，均由合格的三家医院进行提供。收集及采集样本的知情权均予以按照要求告知患者本人或其直系家属。所有患者经院伦理委员会通过审批，并在知情同意书签字。

1.2 方法[6-8]

1.2.1 细胞培养 人PBMC在96孔培养板上按1×105细胞/孔进行平铺，在培养液中吸附2 h后将其移去，然后用含体积分数为0.2%BSA及2 μg/ml的TPCK-trypsin的RPMI1640培养基于37 ℃、含体积分数为5%二氧化碳（CO2）饱和湿度恒温细胞培养箱中培养。待细胞长至对数生长期并传代至足够数量时，冻存，准备实验。

1.2.2 肺组织感染 取人肺组织部位切成2～3 mm小块状物，感染剂量达到104PFU/ml。在培养液中吸附2 h后将其移去，然后用含体积分数为0.2%BSA及2 μg/ml的TPCK-trypsin 的RPMI1640培养基于37 ℃、含体积分数为5%二氧化碳（CO2）饱和湿度恒温细胞培养箱中培养。

1.2.3 荧光定量聚合酶链式反应（Fluorescence Quantitative Polymerase Chain Reaction，PCR术） 切取适当大小组织利用免疫组化试剂盒（上海基因科技），使用OMEAE.Z.N.A.TM Micro Elute Total RNA Kit 提取组织 mRNA，用Takara Prime Script RT reagent kit withg DNAeraser 试剂盒逆转录成cDNA（-20 ℃储存备用），然后用SYBR Green进行荧光定量PCR。再使用特异性引物进行扩增。每个样品3个复孔，取阈值循环（Threshold Cycle，CT）平均值。

1.3 统计学方法

采用SPSS 14.0统计软件进行比较分析，多组间单因素选择采用单因素方差分析进，以P0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 H7N9病毒在人PBMC的复制水平

经定量PCR荧光反应人PBMC中H7N9病毒的复制水平结果显示，在感染后尤其在24 h时重症分离菌株GD-7其复制能力高于轻症分离菌株GD-6的复制水平值，差异具有统计学意义（P0.05），见表1。

2.2 H7N9病毒在人肺组织的增殖力

经荧光PCR定量反应人肺组织中H7N9病毒的复制能力从结果显示可知在发生感染后在24 h时与轻症分离菌株GD-6的增殖能力相比，其重症分离菌株GD-7其增值水平要远远较高，差异具有统计学意义（P0.05），见表2。

2.3 两个病毒菌株对小鼠的致病力

两株病毒GD-6及GD-7在发生感染3～9 d后，小鼠均无小鼠死亡病理。两组中的小鼠虽无体质量下降现象但GD-7 发生小鼠感染的体质量增加速度较GD-6小鼠慢，见表3。

表1 H7N9病毒在人PBMC的复制水平结果

表2 H7N9病毒在人肺组织培养中的增殖能力

表3 H7N9病毒对小鼠的致病力

3 结论

禽流感病毒在病毒分类标准上归为正粘病毒科中的甲型流感病毒属，作为一种分节段的单负链RNA病毒。目前有关报道已证实可直接感染人类的禽流感病毒属主要有H5N1、H9N2、H7N7、H7N7等。有文献报道其携带病毒感染者具有不同的临床结局可能与其宿主易感性及病毒本身的特性存在一定关联[9]。目前，H7N9禽流感病毒作为一类新型且具有高致病性的禽流感病毒。在临床中进行对抗人感染H7N9禽流感病毒问题较为复杂，尚未存在较好解决措施。有研究发现当H7N9禽流感病毒在流行过程中经过基因重组及氨基酸位点发生突变，且处于不断变化中，当每次流行发病期间病毒的分离株分子发生了遗传特性和致病性，且均表现出较大的差异性，提出将追溯毒株来源及变异动向可能有助于对H7N9的防控[10]。

本文对轻症和重症感染者携带H7N9禽流感病毒GD-6及GD-7进行相关的研究分析表明重症H7N9病毒在人PBMC、人肺组织的增殖力与复制水平要高于轻症H7N9病毒。且重症H7N9病毒较轻症H7N9病毒致病力要强。因此对轻、重症病例进行研究可全面系统地对H7N9 禽流感病毒的特征和致病毒力相互关联性进行分析，为H7N9禽流感病毒的致病性提供科学依据，也为临床治疗提供一定的指导意义。

[1]于海艳，陈新华，李菁．2例人感染 H7N9 禽流感病毒重症患者的护理干预[J]．现代医学，2014，42（10）：1214-1217．

[2]毛青．科学认识 H7N9，有效防控人感染禽流感病毒[J]．第三军医大学学报，2013，35（8）：693-695．

[3]UYEKI TM，COX NJ．Global concerns regarding novel influ-enza A (H7N9) virus infections[J]．N Engl J Med，2013，368（20）：1862-1864．

[4]吕珍芳，张晓培，王丹丹．重症甲型 H7N9 型禽流感患者的护理[J]．中国实用护理杂志，2013，29（25）：42-43．

[5]陈聚兴，陈瑞丽，伍尚剑．感染性指标对人感染H7N9禽流感的诊疗价值研究[J]．中国实用医药，2016，11（20）：92-95．

[6]方丹云，郭晓兰，于玉凤，等．轻症和重症人感染 H7N9 禽流感病毒的致病性[J]．中山大学学报，2016，37（6）：829-833．

[7]郭晓兰，司露露，管大伟．两株人H7N9 禽流感病毒的全基因组测序及分子特征分析[J]．中山大学学报（医学科学版），2015，36（2）：168-173．

[8]Liu J，Zhang J，Huang F，et al．Complex reassortmentof polymerase genes in Asian influenza A virus H7 and H9 subtypes[J]．Infect Genet Evol，2014，23：203-208．

[9]柴程良，陈恩富，陈直平，等．浙江省6例人感染 H7N9 禽流感确诊病例的临床与流行病学特征分析[J]．中华流行病学杂志，2013，34（5）：443-445．

[10]Belser JA，Gustin KM，Pearce MB，et al．Pathogenesis and transmission of avian influenza A（H7N9） virus in ferrets and mice[J]．Nature，2013，501（7468）：556-559．

Study on Pathogenicity of Mild and Severe Strains H7N9 of Avian Inf l uenza Virus

C AO Fu Department of Respiratory Tuberculosis, Red-Cross Hospital of Yulin City, Yulin Guangxi 537000, China

ObjectiveTo analyze the pathogenicity of mild strain and severe strain H7N9 of avian inf l uenza virus and to explore the association between the molecular characteristics of viruses and their pathogenic differences.MethodsGD-6 and GD-7 were isolated from patients infected with mild or severe H7N9 virus. There models were used in this research, PBMC in vitro cultured and infected by virus, human lung tissue culture and virus infection and mouse infected with H7N9 animal model. Then the pathogenicity of the two strains of the H7N9 virus were analyzed and compared.ResultsIn the three models the virus could infect tissue and reproduce, and GD-7 strain more effectively than GD-6 strain. In the lung tissue of mice, the degeneration of GD-7 virus with higher pathogenicity than that of GD -6 strain.ConclusionGD-7 as a severe isolated strain has stronger ability of replication and pathogenicity than GD-6 strain which isolated from mild H7N9.

mild; severe; H7N9 avian inf l uenza virus; pathogenicity

R440

A

1674-9308（2017）13-0196-03

10．3969/j．issn．1674-9308．2017．13．109

广西玉林市红十字会医院呼吸结核科，广西 玉林 537000