侯丽娟，翟建军

首都医科大学附属北京同仁医院妇产科(北京 100176)

·临床病理·

PAR1、PAR4在宫颈癌中的表达及临床意义

侯丽娟，翟建军△

首都医科大学附属北京同仁医院妇产科(北京 100176)

目的：对宫颈癌组织中PAR1和PAR4基因的表达进行检测，并对其相关的临床意义进行探讨。方法：选取宫颈癌患者手术切除标本84例，所有病例经病理确诊，对照为癌旁非癌宫颈组织。对患者的年龄、有无淋巴结转移、肿瘤分化程度及临床TNM分期分组对照HPV16和P16基因的表达。RT-PCR检测PAR1和PAR4 mRNA的表达，荧光定量PCR检测PAR1和PAR4基因的表达量。结果：宫颈癌标本中PAR1和PAR4基因的表达率分别为63.1%和72.6%，显著高于癌旁正常对照宫颈组织的21.4%和29.8%(P均<0.01)。PAR1和PAR4基因在宫颈癌标本中的表达量分别为0.61±0.15和0.67±0.17，也显著高于对照组织的0.13±0.07和0.21±0.08(P均<0.01)。PAR1和PAR4基因的表达率和表达量在患者肿瘤分化程度、有无淋巴结转移及临床不同分期之间都存在统计学差异(P<0.05)，但不同年龄患者之间无统计学差异(P>0.05)。相关性分析显示宫颈癌组织中PAR1和PAR4基因的表达呈正相关(r=0.664，P<0.01)。结论：PAR1和PAR4基因的高表达在宫颈癌的发生发展中起到一定的作用，对其联合检测有可能用于宫颈癌分化程度的评估、临床分级以及判断预后等方面。

据调查显示，世界各国的肿瘤发病率及病死率逐年升高，目前已成为继心血管病之后现代人类的第二大杀手[1]。在女性的恶性肿瘤中,宫颈癌的发生率仅次于乳腺癌，全世界每年约有50万妇女患病，居女性生殖道肿瘤发病首位，且有年轻化的趋势。对妇科肿瘤的准确诊断及正确的预后判断是近年研究关键点[2-3]。蛋白酶激活受体 (Protease activated receptors, PARs) 是一个G蛋白偶联受体家族，有PAR1-4四个成员组成，PARs激活后可以级联激活G蛋白调控下游通路的转导刺激细胞增殖、肿瘤形成和转移，PAR1-3由凝血酶激活，而PAR2由胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶激活[4-5]，目前PAR1研究的比较多，主要集中在黑色素瘤方面，而PAR4则较少涉及[6]。本文对宫颈癌患者组织中PAR1、PAR4基因的表达情况进行检查，并对其与宫颈癌的关系及相关的临床意义进行探讨，现报告如下。

材料与方法

1 标本来源 选取我院2010年1月至2016年6月妇产科行手术治疗的宫颈癌患者手术切除标本84例，并经术后病理学诊断证实确诊为宫颈癌，其中年龄 36～76 岁，平均年龄(59.2±13.1)岁。根据临床TNM分期划分：I 期患者12例、Ⅱ期患者20例、Ⅲ期患者 31例、Ⅳ期患者 21例，同时每例另取癌旁非癌的正常宫颈组织的鳞状上皮制成标本作为对照。所有入选病例术前均未接受放疗、化疗或其他生物治疗。

2 主要试剂和仪器 采用Trizol、RT-PCR试剂盒(购自于北京天根生化科技有限公司)及SYBR Green荧光定量检测试剂盒(购自于大连宝生物公司)。主要仪器有：石蜡切片机、离心机，免疫组化专用湿盒、光学显微镜、恒温箱、冰箱等等。

3 组织的提取及合成

3.1 组织总RNA提取的方法：首先取50～60mg实验肿瘤或癌旁，在液氮中研磨匀浆后，加入1 ml Trizol提取细胞总RNA，并严格按照试剂盒说明书进行操作，具体方法如下：吸取实验组织裂解物置入干净的1.5ml EP管加入0.2 ml氯仿，在剧烈振荡15 s 后，放置室内15 min，12, 000 rpm 4°C离心15 min，小心吸取上清置入另一支干净的EP管中。在上清中加入0.5 ml异丙醇，颠倒混合后，室温静置10 min后，12 000 rpm 4°C离心10 min，将75% 乙醇轻轻颠倒洗涤沉淀2次，然后加入DEPC水溶解，用紫外分光光度计来测定细胞总RNA在260 nm和280 nm处的光密度值(OD)，同时计算RNA的含量及纯度。

3.2 cDNA第一链合成的方法：反转录合成cDNA第一链：2 μg RNA，2 μl Olig (dT)15，1mM dNTP mixture，5mM DTT，200U TIANScript M-MLV，40 U RNasin，4 μl 5×First-Strand Buffer，加入DEPC处理灭菌蒸馏水至总反应体系20 μl。在40 °C 下孵育1 h，在95°C时孵育5 min中止反应，取其样品-70°C冻存。

4 RT-PCR步骤

4.1 PCR反应扩增目的片段：2 μl cDNA，0.2 μl Primer F (50 μΜ)，0.2 μl Primer R (50 μΜ)，12.5 μl2× Taq Plus MasterMix，加ddH2O至总反应体系25 μl。

扩增片段：PAR1：Sence:5'- TTCAGTCTGTGCGGCCCGCTGTT-3'

Antisence: 5'-CCAGGTGCAGCATGTACACCACC -3'；PAR4：Sense: 5'- GGCAACCTCTATGGTGCCTA -3', antisense: 5'- TTCGACCCAGTACAGCC TTC-3'；β-actin: Sence: 5'- TCGGAGTCAACGGATTTGGTCGTA-3'，Antisence: 5'- AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGA-3'。

4.2 扩增反应的条件：94°C 5 min，94°C 30 s，60°C 40 s，72°C 1 min，35个循环； 72°C 10 min。100V 2% 琼脂糖凝胶电泳45 min，凝胶成像仪拍照。

5 实时定量荧光PCR (Real-Time PCR) 参照SYBR Green Real-time PCR检测试剂盒的使用说明书进行操作，采用ABI Prism7500荧光定量PCR仪来检测PAR1、PAR4基因的表达情况。0.2ml PCR反应管加入上下游引物，反应条件为：95C 1min；95C 15s， 60C 15s，72C 20s，35个循环。以β-actin基因作为内参照。PAR1：Sence:5'- CCTTCATCTACTACTACTACGTGTCG-3'

Antisence: 5'- ACTGGAGCAAAGAGGAGTGG -3'；PAR4：Sense: 5'- GGCAACCTCTATGGTGCCTA -3', antisense: 5'- TTCGACCCAGTACAGCC TTC-3'；β-actin: Sence: 5'- ATGGGGAAGGTGAAGGTCG-3'，Antisence: 5'- GGGGTCATTGATGGCAACAATA-3'。Ct值表示基因扩增达到阈值的循环数，当 Ct值越小时表明该基因的表达就越多，顾根据内参的Ct值能够计算出△Ct值即△Ct值=目的基因Ct值-内参基因Ct值，通过△Ct值能够间接的反映出目的基因的相对表达水平，目的基因的表达量采用2-△Ct来评估。

结 果

1 两组在PAR1和PAR4表达上的比较 检测结果显示，84例宫颈癌标本中检出PAR1基因的表达53例(63.1%)，癌旁正常对照组织PAR1基因检出18例，检出率为21.4%，经统计学分析，两组比较有统计学差异(P〈0.01)。宫颈癌标本中检出PAR4基因的表达61例(72.6%)，而癌旁正常对照组织仅有25例检出PAR4基因，表达率为29.8%，两组之间比较有统计学差异(P<0.01)，见表1。

Real-Time PCR结果显示，PAR1基因在宫颈癌标本和正常对照组织中的表达量分别为0.61±0.15和0.13±0.07，两组之间比较有统计学差异(P<0.01)；PAR4基因在宫颈癌标本和正常对照组织中的表达量分别为0.67±0.17和0.21±0.08，两组之间的表达量比较亦有统计学差异(P<0.01)。

2 PAR1和PAR4与病理学的关系 患者肿瘤的分化程度、有无淋巴结转移和临床TNM不同分期与PAR1、PAR4基因的表达之间存在统计学差异(P<0.05)，而与患者的年龄之间无统计学差异(P>0.05)，见表2。

表1 PAR1和PAR4基因在良、恶性宫颈组织中的表达[例(%)]

注：与对照组比较，*P<0.01

表2 宫颈癌组织中临床指标与PAR1和PAR4 mRNA表达之间的关系

注：不同临床指标两组之间比较，*P<0.05，△P<0.01

3 宫颈癌组织中PAR1和PAR4基因表达的相关性分析 Spearman等级相关分析显示宫颈癌组织中PAR1和PAR4基因的表达呈正相关(r=0.664，P<0.01)。

讨 论

肿瘤的发生发展是一个多阶段、多因素、多步骤、多基因的漫长演化过程。蛋白酶激活受体(PAR)1、4是凝血酶的下游靶蛋白，在多种实体肿瘤中表达上调，例如黑色素瘤、乳腺癌、肝癌等，另外凝血酶本身对肿瘤的生长和转移具有促进作用，并且还可以刺激肿瘤血管的生成，提示了PAR1和PAR 4在恶性肿瘤中的检测意义重大[7]。PAR1和PAR 4具有7个跨膜单位，只有在胞外区水解后，受体的胞内区才能发挥活性，其主要是通过调节G蛋白的下游信号转导通路来发挥生物学特性，例如激活Src激酶活化Erk通路；增加EGFR的磷酸化；活化NF-κB通路；激活MMPs途径等，上述的信号通路都与肿瘤的发生和发展有着密切的关系[8]。我们对宫颈癌组织PAR1和PAR 4基因表达的检测显示癌组织中PAR1和PAR 4基因的表达率和表达量显著高于癌旁对照宫颈组织(P<0.01)，提示了PAR1和PAR 4基因的激活在宫颈癌发生中起重要作用。

有研究显示PAR-1可以通过调节缝隙连接蛋白Connexin 43和肿瘤抑制基因Maspin的表达来促进肿瘤的转移，并且使用凝血酶或者PAR-1的激活剂可以唤醒处于休眠期的肿瘤细胞，诱导细胞的有丝分裂，增加细胞的侵袭和迁移能力，在一项胃癌的研究中显示PAR-1的表达与肿瘤的侵犯和淋巴结转移密切相关[9-10]。在肝癌中的研究显示PAR-4的拮抗剂可以减弱凝血酶介导的肝癌细胞的侵袭、转移活性，显示PAR-4可以作为一个肿瘤治疗的靶点[5]。上述的研究提示PAR1和PAR 4有可能成为肿瘤转移和预后评估的有效标志，值得进一步深入研究。本研究结果显示，PAR1、PAR4基因的表达与宫颈癌分化程度、有无淋巴结转移和临床不同分期之间存在统计学差异(P<0.05)，并且PAR1和PAR4的表达有随着肿瘤分化程度的减低，淋巴结的转移和临床分期的进展而表达逐渐增加的趋势，这表明PAR1和PAR4在宫颈癌的恶性程度判定上具有一定的敏感性，能够预示着患者的预后。另外相关性分析显示PAR1和PAR4在宫颈癌中的表达呈正相关，提示PAR1和PAR4的联合检测将会提高二者的临床应用价值。

综上所述，PAR1和PAR4在宫颈癌的发生发展中具有一定的作用，对肿瘤的分级、判断预后等方面有指导意义，值得临床上进一步研究和探讨。

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(收稿：2016-12-12)

The expresssion of PAR1 and PAR4 in human cervical carcinoma and its clinical significance

Hou Lijuan,Zhai Jianjun.

Department of Obstetrics and Gynecology,Beijing Tongren Hospital, Capital Medical University(Beijing 100176)

Objective：To investigate the mRNA expression and clinical significance of protease activated receptor1(PAR1) and protease activated receptor4(PAR4) in human cervical carcinoma. Methods：84 patients were enrolled in our study. The cervical carcinoma tissues and adjacent normal cervical tissues were collected for RT-PCR and Real-time PCR analysis. Results：The positive expression rates of PAR1 were 63.1% and 21.4% in cervical carcinoma and normal tissues, respectively(P<0.01). The positive expression rates of PAR4 were 72.6% and 29.8% in cervical carcinoma and normal tissues, respectively(P<0.01). Real-time PCR analysis showed that the 2-△Ctvalues of PAR1 were 0.61±0.15 and 0.13±0.07 in cervical carcinoma and normal tissues, respectively(P<0.01). The 2-△Ctvalues of PAR4 were 0.67±0.17 and 0.21±0.08 in cervical carcinoma and normal tissues, respectively(P<0.01). The mRNA expression of PAR1 and PAR4 was significant related with differentiation,lymphatic metastasis, and clinical pathologic stage in human cervical carcinoma(P<0.05). The mRNA expression of PAR1 was positively related to that of PAR4 (r=0.664，P<0.01). Conclusion：The overexpression of PAR1 and PAR4 have a closed relationship with the development of human cervical cancer. The combined detection of PAR1 and PAR4 might be used as the marks for estimating the prognosis of cervical carcinoma.

Uterine cervical neoplasms/pathology Receptors,proteinase-activated/analysis

子宫颈肿瘤/病理学 受体，蛋白酶激活/分析

R363

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.07.052

△通讯作者