李 华，黄娟娟

延安大学附属医院产科(延安 716000)

·临床研究·

亚甲基四氢叶酸还原酶基因677多态性与复发性流产相关性分析*

李 华，黄娟娟

延安大学附属医院产科(延安 716000)

目的：探讨亚甲基四氢叶酸还原酶基因(MTHFR)677多态性与复发性流产的相关性。方法：选取复发性自然流产患者50例作为观察组，另选取同期正常妊娠者50例作为对照组；采用PCR-RFLP方法对两组MTHFR基因多态性(C677T)进行检测分析，并观察分析患者妊娠结局。结果：观察组患者CC基因型比例(14.00%)明显低于对照组(44.00%)，CT基因型比例(50.00%)则明显高于对照组(26.00%)，差异具有统计学意义(P<0.05)；观察组患者MTHFR T等位基因分布频率(64.00%)明显高于对照组(46.00%)，差异具有统计学意义(P<0.05)；观察组三种不同基因型患者其血清同型半胱氨酸水平分布之间存在差异(P=0.000)，其中以TT基因型患者最高[(18.9±9.4)mmol/L]，CT型患者最低[(11.6±4.2)mmol/L]。结论：MTHFR基因677多态性同复发性流产密切相关，其中基因位点C→T突变可造成孕妇血同型半胱氨酸水平上升，造成胎儿发育障碍，引起流产风险上升，临床可通过给予孕妇叶酸口服以降低流产风险。

复发性流产(Recurrent pregnancy loss，RPL)指的是连续2次以上在妊娠20周以内发生的自然流产，其发生率约在1%～5%左右[1]。RPL的致病因素较为复杂，如精神因素、血型不合、免疫因素、染色体异常等均会导致RPL，当前临床尚无明确结论。近年来有报道指出，5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因(Methylene tetra-hydrofolate reductase，MTHFR)多态性(C677T)同RPL之间存在一定相关性[2]。相关报道显示，MTHFR C677T基因突变所致复发性流产主要通过两种途径进行：①MTHFR C677T基因位点突变引起DNA正常甲基化受阻，导致胎儿发育过程中无法获得充足DNA；②MTHFR C677T基因位点突变引起血同型半胱氨酸代谢障碍，高同型半胱氨酸血症可造成胎盘血栓形成，引发流产[3]。本次研究以近年来本院收治的RPL患者50例作为观察对象，对其MTHFR基因多态性(C677T)同RPL之间的相关性进行分析，现报告如下。

资料与方法

1 一般资料 选取2014年1月至2016年10月期间本院收治的复发性自然流产患者作为观察组，所有患者均存在2次或2次以上自然流产病史，且符合以下纳入标准[4]：①夫妇双方均无染色体异常；②抗核抗体、抗心磷脂抗体检查呈阴性；③未合并高血压、糖尿病、甲状腺机能亢进等内科疾病；③年龄在40岁以下；⑤影像学检查显示患者无生殖器肿瘤或解剖学畸形。观察到共计纳入50例，年龄22～36岁，平均(31.5±4.9)岁；其中包括孕16～20周流产1例，孕3个月内流产49例；29例连续2次流产，21例连续3次及其以上流产。另选取同期本院分娩正常妊娠者50例作为对照组，年龄23～37岁，平均(32.1±5.3)岁，均符合以下纳入标准：①存在1次以上正常生育史；②无胎儿宫内发育缺陷、死产、死胎、自然流产等异常妊娠病史；③无糖尿病、高血压、甲状腺机能亢进等内科疾病；④年龄在40岁以下。

2 检测方法 采集100例受试对象肝素抗凝血4ml，将其保存以待DNA提取。另取非抗凝血4ml，1000×g离心15min，提取上层血清，采用酶法对其血清同型半胱氨酸水平进行测定，相关试剂盒由北京九强生物技术有限公司生产，所有操作均按照说明书进行。DNA提取试剂盒择优北京天根生化有限公司生产，从全血标本中对基因组DNA进行提取。之后按照Frosst P等文献中所示方法进行MTHFR引物合成，其中上游引物为5’-TGAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGA-3’,下游引物则为5’-AGGACGGTGCGTGAGTG-3’，预计扩增片段长度取198 bp，按照相关文献中所示扩增条件进行设定，对PCR产物采用20g/L琼脂糖进行凝胶电泳检测。然后使用20μl限制性内切酶反应体系，按照美国NEB公司所提供试剂盒相关说明书进行操作，取2号反应缓冲液2μl，BSA 0,2μl，PCR产物8μl，双蒸水8,8μl，内切酶Hinf 1μl，在37℃水浴环境下过夜。使用25g/L琼脂糖进行100V电泳，持续25min，使用溴化乙锭进行染色，并在紫外灯下对基因型进行读取。

3 评估方法 NTHFR677基因扩增片段长度为198bp，其中若677基因位点可被内切酶Hinf切开，并产生长度分别为23 bp、175 bp的2个片段，23 bp片段在电泳后由于长度过小无法显示，175 bp片段则可在电泳图上显示为清晰条带，则为TT基因型；如677基因位点无法被内切酶切开，仅存在198 bp条带，则此位点为CC基因型；如677基因位点可被酶切，且共产生23bp，175bp，198bp3个片段，在电泳图上可观察到175bp、198bp两个条带，则此位点为CT基因型。

4 统计学方法 采用SPSS18.0统计学软件，计量资料以平均值±标准差的形式表示，采用t检验，计数资料以百分比的形式表示，采用χ2检验，P<0.05时认为差异具有统计学意义。

结 果

1 C677T分布情况 两组MTHFR基因677位点基因型分布情况存在一定差异，但两组患者TT基因型的分布比较并无统计学差异(P>0.05)，但其中观察组患者CC基因型比例明显低于对照组，CT基因型比例则明显高于对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)，见表1。两组患者MTHFR677基因限制性内切酶酶切后电泳结果，见图1。

表1 MTHFRC677T基因型在两组患者中的分布情况[例(%)]

注：与观察组比较，△P<0.05

图1 MTHFR677基因电泳结果

2 MTHFR等位基因分布情况 观察组患者MTHFR T等位基因分布频率明显高于对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 MTHFR等位基因分布情况[例(%)]

注：与观察组比较，△P<0.05

3 两组同型半胱氨酸 观察组患者血清同型半胱氨酸水平平均(15.9±7.4)mmol/L，对照组(14.5±7.6)mmol/L，观察组患者明显高于对照组(P<0.05)。其中，观察组中TT基因型患者血清同型半胱氨酸水平平均(18.9±9.4)mmol/L，CC型患者(12.9±6.5)mmol/L，CT型患者(11.6±4.2)mmol/L，三种不同基因型患者其血清同型半胱氨酸水平分布之间存在明显统计学差异(P=0.000)，其中以TT基因型患者最高，CT型患者最低。

4 治疗及转归 观察组50例患者均接受叶酸5mg/d口服治疗，治疗1个月后，患者血清同型半胱氨酸均恢复正常，随后将药量下降至0.4mg/d。其中26例患者再次怀孕，均顺利足月分娩；5例CT基因型患者妊娠后由于妊娠糖尿病、高血压等在孕30周左右行剖宫产，其中1例早产儿死亡，4例顺利存活。

讨 论

同型半胱氨酸是一种含硫氨基酸，其水平主要受营养和遗传两方面因素影响。既往研究证实，血清高同型半胱氨酸水平可造成RPL风险上升，其中，血浆同型半胱氨酸水平轻度上升即可造成胚胎发育障碍，引起流产[5]。因此，近年来部分报道指出，可从同型半胱氨酸代谢机制方面对RPL的发生机制进行研究。米蔓丽等[6]研究指出，可对RPL患者同时进行MTHFR基因多态性和空腹同型半胱氨酸筛查，以对其流产风险进行评估，并及早采取干预措施。

MTHFR在四氢叶酸和半胱氨酸代谢中发挥着十分重要的作用，MTHFR基因主要位于染色体1p36.3位点，其中该基因677位核苷酸C突变为T后，可造成该位点由丙氨酸突变为缬氨酸，造成MTHFR活性下降，引起5-甲基四氢叶酸合成受阻，同时对同型半胱氨酸复甲基化造成抑制，引起机体同型半胱氨酸水平上升，从而引发高同型半胱氨酸血症，造成妊娠妇女流产风险增加[7]。本次研究结果显示，观察组血清同型半胱氨酸水平明显高于对照组，提示血清高同型半胱氨酸水平同复发性流产的发生之间存在密切联系，符合临床研究的基本结论。

黄晓玲等[8]对胎盘组织中MTHFR基因多态性同酶活性之间的相关性进行了分析，指出MTHFR C677T突变可致酶活性降低。王苏梅等[9]对MTHFR突变同羊水中同型半胱氨酸水平之间的关联性进行了探讨，指出羊水中同型半胱氨酸水平上升可导致神经管畸形，认为MTHFR基因突变同胎儿丢失之间存在密切联系。临床研究证实，MTHFR C677T位点基因突变可造成甲硫氨酸合成受阻，从而导致DNA无法顺利甲基化，造成等位基因选择异常。胡晓东等[10]指出，异常甲基化同胚胎正常发育失败之间存在密切联系。MTHFR活性下降可导致胎盘组织中核酸、嘌呤、嘧啶代谢障碍，导致胎儿发育过程中无法获得充足DNA及甲基化蛋白质，从而造成流产[8]。此外，既往研究证实，MTHFER酶活性降低可造成血清同型半胱氨酸水平上升，从而导致胎盘血栓形成风险上升，引起流产[9]。本次研究显示，观察组中CT、TT基因型所占比例明显高于对照组，且前者T等位基因频率明显高于后者，同相关报道结论基本一致，表明MTHFR基因C677T基因C→T突变同复发性流产之间密切相关[10]。此外，临床研究显示，叶酸口服可有效治疗高同型半胱氨酸血症[11]。在本次研究中，观察组50例患者经叶酸口服治疗其血清同型半胱氨酸水平均显著下降，其中部分患者顺利妊娠并分娩。提示对于携带复发性流产易感基因型孕妇，应加强其叶酸补充计划，以促进孕妇妊娠期间血同型半胱氨酸水平的下降，从而促进复发性流产风险降低。

综上，MTHFR基因677多态性同复发性流产密切相关，其中基因位点C→T突变可造成孕妇血同型半胱氨酸水平上升，造成胎儿发育障碍，引起流产风险上升，临床可通过给予孕妇叶酸口服以降低流产风险。

[1] 张红玲,穆荣红,谭利娜.亚甲基四氢叶酸还原酶基因C677T多态性与习惯性流产相关的Meta分析[J].中国优生与遗传杂志,2012,18(3):15-16.

[2] 韩红敬,沈 浣,王艳槟,等.亚甲基四氢叶酸还原酶基因677位多态性、高同型半胱氨酸血症与复发性流产[J].生殖与避孕,2012,34(7):486-489,477.

[3] 尹 璐,吕永刚.亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性与自然流产的相关性分析[J].吉林医学,2012,55(21):4520-4521.

[4] 陈惠丽,唐落韵,陈春宝,等.不明原因复发性流产与亚甲基四氢叶酸还原酶及甲硫氨酸合成酶还原酶基因多态性研究[J].中国优生与遗传杂志,2013,19(6):29-30,36.

[5] 刘宇岩,杨博逸,李永芳,等.5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶C677T基因多态性与原因不明复发性流产关联的Meta分析[J].中国全科医学,2013,16(31):2992-2997.

[6] 米蔓丽,宋炎鑫,艾海权,等.亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性与原因不明复发性流产相关性的Meta分析[J].中国循证医学杂志,2016,16(8):897-905.

[7] 鲁衍强.亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性与不孕不育症的研究进展[J].新医学,2012,43(7):511-514.

[8] 黄晓玲,何艳君,鲁衍强,等.亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性与先兆流产相关性研究[J].赣南医学院学报,2015,36(1):41-43,47.

[9] 王苏梅,贾颐舫,杨丹彤,等.MTHFR基因C677T多态性与原因不明复发性自然流产的相关性[J].中国妇幼保健,2011,26(9):1385-1387.

[10] 胡晓东,梁佩燕,刁梁辉,等.亚甲基四氢叶酸还原酶基因突变与不明原因复发性流产的关系[J].中国优生与遗传杂志,2014,20(11):87-89.

[11] 马亚玲,吴海琴,张 萌,等.高同型半胱氨酸血症伴急性脑梗死患者周围神经传导速度临床观察[J].陕西医学杂志,2015,44(7):877-878.

(收稿：2017-01-09)

Association of methylenetetrahydrofolate reductase gene 677 polymorphism with recurrent spontaneous abortion

Li Hua, Huang Juanjuan.

Department of Obstetrics and Gynecology,Affiliated Hospital of Yan’an University (Yan’an 716000)

Objective: To investigate the association of methylenetetrahydrofolate reductase gene (MTHFR) 677 polymorphism with recurrent spontaneous abortion. Methods: Selected patients with recurrent spontaneous abortion 50 cases as the observation group, were selected 50 cases of normal pregnancies as control group, using the method of PCR-RFLP of two groups of MTHFR gene polymorphism (C677T) detection and analysis, observation and analysis of patients with pregnancy outcome.Results: The proportion of CC genotype was significantly lower in the observation group (14.00%) than that in the control group (44.00%) and the CT genotype (50.00%) was significantly higher than that in the control group (26.00%) (P<0.05 ). The frequencies of the MTHFR T allele in the observation group were significantly higher than those in the control group (64.00% vs 46.00%,P<0.05). The serum homocysteine [(18.9 ± 9.4)mmol / L], and the lowest in CT patients [(11.6 ± 4.2)mmol / L] .There was a significant difference between the two groups (P= 0.000). Conclusion: MTHFR 677 polymorphism is closely related to recurrent spontaneous abortion. C → T mutation in gene locus can lead to the increase of blood homocysteine level in the pregnant women. It may cause fetal developmental disorder and increase the risk of miscarriage. Folic acid oral to reduce the risk of miscarriage.

Abortion Methylenetetrahydrofolate reductase Polymorphism,genetic Gene conversion

*陕西省自然科学基金资助项目(2012JM741203)

流产 亚甲基四氢叶酸还原酶 多态现象，遗传学 基因转变

R392.3

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.07.012