张 祎,苏慎勇,杨卫东,安 琳,许 敏,, 李海飞 ,李 磊, 郭 芳

1.河北省保定市第二医院 (保定 071000)，2.河北大学附属医院(保定 071000)

热疗联合奥沙利铂对胃癌MGC803细胞X连锁凋亡抑制蛋白和血管内皮生长因子表达的影响*

张 祎1,苏慎勇2△,杨卫东1,安 琳2,许 敏,1, 李海飞1,李 磊1, 郭 芳1

1.河北省保定市第二医院 (保定 071000)，2.河北大学附属医院(保定 071000)

目的：探索奥沙利铂(OXA)热化疗对人胃癌MGC803细胞血管内皮生长因子(VEGF)和X连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)表达的影响。方法：将人胃癌MGC803细胞株,密度为5×104个/ml分为正常对照组、单纯热疗组、单纯化疗组、热疗联合化疗组，各组细胞培养48h后， MTT法检测细胞增殖抑制率，确定工作浓度为48h的半数抑制浓度(IC50)。应用流式细胞术(FCM)和逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测四组细胞对VEGF和XIAP蛋白及mRNA表达变化，并分析影响因素。结果: FCM及RT-PCR分析显示与对照组比，热疗组、化疗组及热化疗组VEGF和XIAP表达下调，热化疗组VEGF与XIAP下调最显著，各组之间比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。结论: 热疗联合奥沙利铂能抑制人胃癌细胞增殖，促进细胞凋亡，两者联用强于单独使用热疗或奥沙利铂，其作用机制与下调VEGF和XIAP表达有关。

热疗能引起相关基因表达导致细胞凋亡，因此直接杀伤肿瘤细胞，热疗能通过激活半胱氨酸蛋白酶-8和9最终显著增加半胱氨酸蛋白酶-3诱导细胞凋亡,并且联合化疗时二者有协同作用进而增强化疗敏感性[1-2]。胃癌是临床上最常见的恶性肿瘤之一,在全球范围内,胃癌的发病率位居所有恶性肿瘤的第四位,病死率为癌症死亡的第二位, 在我国其发病率及病死率居恶性肿瘤之首位[3]。 胃癌发生发展是一个多阶段、多因素参与的过程,研究影响胃癌治疗的分子标志物的基因水平的改变,有助于提高肿瘤治愈率[4]。本研究目的在于探索奥沙利铂(OXA)热化疗对人胃癌MGC803细胞血管内皮生长因子(VEGF)和X连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)表达的影响。

材料与方法

1 药品与试剂 奥沙利铂；RPMI-1640；四氮甲唑蓝(MTT)；兔抗人VEGF，XIAP单克隆抗体，羊抗兔FITC-IgG二抗，反转录试剂盒；引物。

2 细胞株及其培养 将MGC803接种于RPMI1640细胞培养液中，37℃恒温，5%CO2孵箱中传代培养，取对数生长期的细胞进行实验。

3 细胞分组与处理 (根据文献及预实验)计算奥沙利铂的半数抑制率值，分常规对照组，在37℃培养箱中培养；化疗组加入IC50(半数抑制率值)的奥沙利铂；热疗组水浴43℃加热60min；温热化疗组同上。

4 MTT法确定奥沙利铂实验浓度 将密度为5×104个/ml对数生长期的MGC803细胞接种于3个96孔培养板。24h后加药和(或)加温，继续培养12、24、48h后加MTT，加二甲基亚砜(DMSO) 150μl，用酶标仪测OD值 (吸光度)，增殖抑制率=(对照组吸光度均值-实验组吸光度均值)/对照组吸光度均值×100%。测定48h的IC50值作为实验浓度。

5 FCM测定细胞XIAP、VEGF蛋白表达 取1ml单细胞悬液(含1×106个/ml)，分别加入100μl VEGF和XIAP单克隆抗体孵育细胞，洗涤；加入VEGF和XIAP二抗工作液，继续室温孵育后检测。蛋白表达量以均道值(平均荧光强度)表示。均道值=lg(x-mode)×340

6 RT-PCR检测上述各组MGC803细胞VEGF，XIAP的mRNA表达 提取细胞总RNA,分光光度计测浓度。逆转录-聚合酶链反应过程按K1622试剂盒说明书进行。VEGFmRNA、XIAPmRNA与β-actin引物序列如下。VEGF上游引物5′-CGTCTCTCTTGGGTGCACTGG-3′，下游引物5′-CACCGCCTTGGCTTGTCACAT-3′，扩增产物178bp；XIAP上游引物5′-GTGACTAGATGTCCACAAGG-3′，下游引物5′-GTTGAGGAGTGTCTGGTAGG-3′，扩增产物216bp；β-actin上游引物5′-CATCTCTTGCTCGAAGTCCA-3′，下游引物5 ′-ATCATGTTTGAGACCTTCAACA-3′，扩增产物448bp；由上海生物工程有限公司合成。PCR反应体系共25μl，包含cDNA2μl；上、下游引物各2.5 μl；绿色体系(含TaqDNA聚合酶、MgCl2)12.5μl；DEPC水5.5μl。循环参数为：①VEGF：94℃ 预变性2min，94℃变性30s，58℃退火1min，72℃延伸1min，33个循环后 72℃延伸5min终止反应。②XIAP：95℃预变性2min，94℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸1min，30次循环后，72℃延伸10min终止反应。③β-actin：94℃预变性5min，94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸45s，30次循环后，72℃延伸10min。VEGF、XIAP DNA和β-actin各6μl，EB染色，于1%琼脂糖凝胶电泳，紫外透射仪照相，输入微机应用法国VL公司BIO-PROFIF凝胶图象分析系统分析软件对目的电泳条带进行分析，扩增产物的光密度值(D)，结果以两者光密度的比值表示。mRNA表达相对值=目的基因光密度值/β-actin光密度值。以表达强度≥0.10的值定为阳性表达。实验重复3次。

结 果

1 奥沙利铂实验浓度的确定 计算奥沙利铂对MGC803细胞株48h半数抑制率的药物浓度为奥沙利铂的工作浓度为5μg/ml[2]，并用此浓度进行实验。

2 流式细胞术测定MGC803细胞VEGF、XIAP蛋白表达 流式细胞术分析VEGF、XIAP蛋白表达，热化疗显著下调VEGF、XIAP表达，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1、图1、2。

表1 热疗、化疗及热化疗对MGC803细胞中血管内皮生长因子和X连锁凋亡抑制蛋白表达的影响

注：与正常对照组比较，*P<0.05；与单纯热疗组和单纯化疗组比较，△P<0.05

1: 对照组;2: 热疗组;3:化疗组;4：热化疗组

3 逆转录聚合酶链反应半定量检测细胞内VEGF、XIAP mRNA表达 逆转录聚合酶链反应分析VEGF、XIAP mRNA表达，热化疗显著下调VEGF、XIAP表达，差异有统计学意义(P<0.05),见表2、图3、4。

1:对照组;2:热疗组;3:化疗组;4:热化疗组

表2 热疗、化疗及热化疗对MGC803细胞中血管内皮生长因子和X连锁凋亡抑制蛋白 mRNA表达的影响

注：与正常对照组比较，*P<0.05 ；与单纯热疗组和单纯化疗组比较，△P<0.05

1:对照组;2:热疗组;3:化疗组;4：热化疗组

图3 各组MGC803细胞中血管内皮生长因子mRNA表达变化

1:对照组;2:热疗组;3:化疗组;4：热化疗组

讨 论

X连锁凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein,XIAP)是新发现的一个IAP家族中的主要成员，是IAP家族中最强的凋亡抑制因子，XIAP是一种凋亡抑制活性很强的凋亡抑制蛋白，它能直接结合Caspase 9、Caspase 3和Caspase 7等凋亡起始和效应分子并抑制其促凋亡活性。

血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor, VEGF)是正向调控血管生成过程的作用很强的因子，参与多种恶性肿瘤的生长、浸润和转移，与肿瘤病人的预后密切相关[5]。Koltai T研究发现通过联合降低VEGF、 bFGF、NF-κB、 STAT-3、 HIF-1、Alfa、IGF、 EGFR等表达可降低血管生成，促进细胞凋亡[6]。二重酪氨酸激酶抑制剂AEE788和塞来昔布可阻滞细胞周期在G1期作用于直肠癌细胞，通过降低VEGF表达，促进凋亡，减少细胞迁移，证明了同时靶向EGFR/VEGFR有效阻止转移性直肠癌细胞的生长，改进了目前治疗直肠癌的方法[7]。间充质基质细胞通过增加VEGF抑制半胱天冬酶3介导的细胞凋亡减少CD19+B细胞死亡[8]。REG4过表达和重组蛋白可增加Wnt5a、 p70s6k和VEGF表达，阻滞细胞周期在G2/S期，抑制细胞凋亡，促进细胞增殖，侵袭和迁移[9]。研究证明花翠素靶向EGFR/VEGFR2通路诱导非小细胞肺癌细胞的凋亡[10]。还有人发现新型茶氨酚衍生物靶向EGFR/VEGFR-Akt/NF-κB通路诱导肺癌细胞的凋亡抑制增殖[11]。

奥沙利铂是第3代铂类药物，可将DNA铂化抑制DNA的修复及合成，从而诱导细胞凋亡。目前热疗联合奥沙利铂已用于多种肿瘤的治疗。本实验分为正常对照组、单纯热疗组、单纯化疗组、热疗联合化疗组，检测对胃癌MGC803细胞增殖、凋亡的影响。结果显示热疗联合奥沙利铂能有效的抑制胃癌细胞增殖，并诱导细胞凋亡，热化疗组处理MGC803细胞48h后FCM和RT-PCR进行检测VEGF和XIAP在蛋白和mRNA的表达水平。结果发现,奥沙利铂热化疗对MGC803细胞的抑制伴随VEGF和XIAP表达明显减少。由此可提示热疗联合奥沙利铂化疗有可能是通过下调VEGF和XIAP表达,抑制细胞增殖。

综上所述, 推测热疗联合奥沙利铂化疗能增强单纯化疗抑制细胞增殖的作用，从而为后继实验及科学合理地制定临床治疗计划提供体外实验依据。

[1] Liu T, Ye YW, Zhu A,etal.LHyperthermia combined with 5-fluorouracil promoted apoptosis and enhanced thermotolerance in human gastric cancer cell line SGC-7901 [J].Onco Targets Ther, 2015, 27 (8):1265-1270.

[2] 章伟玲， 张玉泉.奥沙利铂热化疗对卵巢癌细胞A2780凋亡及侵袭转移的影响[J].中华实用诊断与治疗杂志， 2013, 27(8) :773-776.

[3] 徐 迅，张长乐.奥沙利铂联合卡培他滨新辅助化疗方案在ⅡB-ⅢC期胃癌中的应用 [J]安徽医药,2015, 19( 5): 978-981.

[4] 李 颖,易 默,何小勤.抑癌基因Reprimo启动子区甲基化在胃癌中表达及其临床意义[J].陕西医学杂志,2015, 44( 3): 272.

[5] Chryso Kanthou, Gabi U，Dachs Diane V，etal. Lefley tumor cells expressing single VEGF isoforms display distinct growth, survival and migration characteristics [J].PLoS One,2014, 9(8); e104015.

[6] Koltai T. Nelfinavir and other protease inhibitors in cancer: mechanisms involved in anticancer activity [J].Version ，2015, 4: 9.

[7] Valverde A, Penarando J. Canas ASimultaneous inhibition of EGFR/VEGFR and Cyclooxygenase-2 targets Stemness-related pathways in colorectal cancer cells [J].PLoS One,2015 ,10(6) :e0131363.

[8] Healy M, Bergin R, Mahon B,etal. Mesenchymal stromal cells protect against caspase 3 mediated apoptosis of CD19+peripheral B cells through contact dependent up-regulation of VEGF [J].Stem Cells Dev, 2015,24(20):2391-2402.

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[11] Zhang G, Ye X, Ji D,etal.Inhibition of lung tumor growth by targeting EGFR/VEGFR-Akt/NF-κB pathways with novel theanine derivatives[J].Oncotarget, 2014,5(18):8528-8543.

(收稿：2016-11-15)

The effect to the expression change of VEGF and XIAP of MGC803 cells with hyperthermia and oxaliplatin

Zhang Wei,Su Shenyong,Yang Weiodong,et al.

The Second Hospital of Baoding in Hebei Provirce(Baoding 071000)

Objective: To investigate the effect and mechanism of hyperthermia combined with oxaliplatin on the expression change of vascular endothelial growth factor(VEGF) and X-linked inhibitor of apoptosis protein (XIAP) of MGC803 gastric cancer cells.Methods: Human gastric cancer MGC803 cells were divided into normal control group, simple hyperthermia group, simple chemotherapy group, hyperthermia combined with chemotherapy group, the cells were cultured for 48h, The working concentration of oxaliplatin was defined as its inhibiting concentration 50%(IC50) at 48 hours action against MGC803 which was determined by MTT assay. The VEGF and XIAP expression of MGC803 were determined by flow cytometric analysis and counter duplication - polymerase chain reaction (revers transcription PCR, RT-PCR) in semi-quantitative examination. Results: chemohyperthermia group could significantly down-regulate expression of VEGF and XIAP of MGC803 cells(P<0.05). Conclusion: Hyperthermia combined with oxaliplatin could inhibit the proliferation of human gastric cancer cells, promote cell apoptosis, the combination is stronger than the use of hyperthermia or oxaliplatin alone, the mechanism is related to the regulation of down-regulation of VEGF and XIAP .

Stomach neoplasms/therapy Platinum compounds/therapeutic use Diathermy @MGC803 cells Vascular endothelial growth factors/analysis @Apoptosis arrestin/protein

*河北省保定市科技局课题(16ZF039)

胃肿瘤/治疗 铂化合物/治疗应用 透热疗法 @MGC803细胞 血管内皮生长因子/分析 @凋亡抑制蛋白

R392.5

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.07.010

△通讯作者