田冰玉，宋虎平

西安市第四医院眼科(西安 710004)

田冰玉，宋虎平△

西安市第四医院眼科(西安 710004)

目的 ： 探讨早期糖尿病视网膜病变(DR)状态下，缺氧诱导因子1(HIF-1)对血管内皮细胞表面细胞间粘附分子-1(ICAM-1)表达的影响。方法 ：收集早期DR患者及年龄匹配的健康人外周血血清，用于体外培养恒河猴视网膜血管内皮细胞系细胞(RF/6A)。分为糖尿病血清培养组(B组)、糖尿病+HIF-1反义寡核苷酸组(ASODN)(C组)、糖尿病+HIF-1正义寡核苷酸组(SODN)(D组)健康人血清培养细胞为正常对照组(A组)。使用免疫组织化学和免疫酶联吸附法(ELISA)检测HIF-1和ICAM-1的表达水平。结果： 在蛋白总量一致的情况下，A组细胞上清中sICAM-1的浓度为(13.89±1.35)ng/ml，而B组的浓度为(25.26±1.97)ng/ml ，HIF-1ASODN 转染可以明显降低细胞ICAM-1的表达水平，其浓度为(16.59±1.11)ng/ml，HIF-1SODN 转染则不能影响细胞ICAM-1的表达。各组细胞之间ICAM-1表达水平比较有统计学差异(F=81.89，P=0.00)，各组之间两两比较，B组和D组之间比较无统计学差异(P=0.98)，其余各组之间两两比较有统计学差异(P均<0.05)。 结论 ：在体外培养条件下， HIF-1对糖尿病血清培养条件下的RF/6A细胞表达ICAM-1具有调节作用。

最新数据显示：目前我国20岁以上的糖尿病患者约9240万(人口的9.7%)，而14820万成年人(15.5%)为糖尿病前期患者。我国已成为全球糖尿病患病人数最多的国家[1]。糖尿病视网膜病变(Diabetic retinopathy, DR)是糖尿病的重要并发症，是成年人重要的致盲眼病。研究证明，髓样细胞与视网膜血管内皮细胞的黏附是DR早期关键事件[2-3]，这个过程和血管内皮细胞表面细胞间粘附分子-1(Intercellular adhesion molecule 1,ICAM-1)的表达有关。细胞间粘附分子-1是促炎细胞因子，可介导白细胞的粘附和聚集，在免疫、炎症等的形成过程中起重要作用[4]。缺氧诱导因子1是一种缺氧反应基因的中介因子，可传导缺氧信号，激化一些与缺氧有关的基因，使细胞适应低氧环境，同时也可引起多种病理变化[5]。缺氧诱导因子1(Hypoxia-indacible factor-1 alpha,HIF-1)能调节DR病变状态下髓样细胞与血管内皮细胞粘附[6]，说明HIF-1有可能成为治疗早期DR的重要靶点，但其是否可调节内皮细胞表面粘附分子ICAM-1尚不清楚。本研究通过体外细胞实验方法，观察在早期DR条件下，HIF-1对血管内皮细胞表面ICAM-1表达的调节，进一步明确HIF-1在DR治疗中的作用机制,现报告如下。

材料和方法

1 材 料 人类血清来自2005年3月至9月在到西安市第四医院眼科门诊就诊的10例1期DR患者及年龄和性别匹配的10例健康志愿者。每一位受试者实验前均签署知情同意书，并经西安市第四医院医学伦理委员会批准。DR分期按照国际临床分类法。晨起抽取空腹血2ml, 离心5min, 取上清，用于细胞培养。

3 内皮细胞系细胞培养和分组 恒河猴视网膜脉络膜血管内皮细胞系(RF/6A)购于中国科学院上海细胞生物所。以含有10%胎牛血清的RPMI1640培养液，在37℃的5%CO2孵箱中培养。待细胞生长至约70%融合状态时，换成无血清的DMEM培养基，24h后A组加入10%健康人血清， B组加入10%DRP患者血清，C组在加入10%DR患者血清之前24h先转染HIF-1反义寡核苷酸[梭华-SofastTM基因转染试剂(厦门太阳马生物工程公司)]D组在加入10%DRP患者血清之前24h先转染HIF-1正义寡核苷酸，37℃ 的5%CO2孵箱中培养24h后收集细胞进行下一步实验。每次实验设3个复孔。共重复3次。

4 HIF-1α免疫组化 细胞爬片并固定，滴加鼠HIF-1α单克隆抗体(Chemicon公司)，浓度1∶500，37℃保温30 min；滴加生物素化羊抗鼠IgG，37℃保温30 min；滴加ABC复合剂，37℃保温30 min；显色，镜下观察，水洗中止反应；苏木素轻度复染；系列酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封固观察。

5 ELISA 检测RF/6A细胞培养中上清液中ICAM-1水平 人sICAM-1 ELISA试剂盒(上海森雄科技实业有限公司)，按照试剂盒说明，建立标准曲线后，将待测品孔每孔加入按一定比例稀释的待测样品100l，置37℃，120 min ；用洗涤液将反应板充分洗涤4～6次，在滤纸上印干；每孔加第一抗体工作液50l后置37℃，60 min后洗板；每孔加酶标抗体上作液100l后置37℃，60 min后洗板；每孔加底物上作液100l，置37℃暗处反应5～10 min；每孔加1滴终止液混匀。在酶标仪(美国BIO-RAD公司)上492 nm处测吸光度(OD值)；用Curve Expert1.3绘制标准曲线，根据曲线公式计算出ICAM-1的浓度。

6 统计学方法 采用SPSS 11.0统计学软件。组间差异用单因素方差分析(ANOVA), 多组之间两两比较采用最小显著性差异法(LSD)。P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 免疫组化染色结果 在正常人血清培养条件下，RF/6A细胞内即有少数阳性染色细胞出现，阳性部位主要在细胞核区，呈棕黄色染色。B组阳性染色细胞增多，阳性染色部位仍然位于胞核区。C组阳性细胞数量较A组减少。D组阳性细胞数量又增加，胞核内呈现深棕色染色(图1)。

图1 四组RF/6A细胞HIF-1免疫组化染色

2 ELISA检测RF/6A细胞培养上清中ICAM-1水平 如图2 ELISA 的标准曲线显示。曲线公式为y=-0.17+55.53x+32.02x2，其中y 代表蛋白量，x代表OD值。

可是，在蛋白总量一致的情况下，A组细胞上清中sICAM-1浓度为(13.89±1.35 )ng/ml，而B组浓度为(25.26±1.97 )ng/ml ，HIF-1ASODN 转染可以明显降低细胞ICAM-1的表达水平，其浓度为(16.59±1.11 )ng/ml，HIF-1SODN 转染则不能影响细胞ICAM-1的表达。各组细胞之间ICAM-1表达水平比较有统计学差异(F=81.89，P=0.00)，各组之间两两比较，B组和D组(25.28±1.02 )ng/ml之间无统计学差异(P=0.98)，其余各组之间两两比较差异有统计学意义(P均<0.05)。

图2 ICAM-1的ELISA检查标准曲线

讨 论

本研究显示，当用来自DR患者的血清培养后，血管内皮细胞ICAM-1水平显著高于正常人血清培养下的水平。HIF-1蛋白表达被抑制后， ICAM-1表达水平相应下降，证明HIF-1对于ICAM-1的表达具有调节作用。 RF/6A细胞是研究视网膜血管内皮细胞病变的常用细胞系，文献证明其具有人类视网膜血管内皮细胞的特征[8]。ICAM-1是CD18位于血管内皮细胞表面的配体，是白细胞与血管内皮细胞黏附的重要分子，是血管内皮细胞的激活的标志[9]。在糖尿病血清培养条件下细胞表达ICAM-1增多的原因和糖尿病代谢紊乱有关，循环血中的炎症介质也是诱导ICAM-1 表达的重要因素。炎症和血管内皮细胞功能障碍之间可能是双向的关系，炎症会加重血管内皮细胞功能障碍，而血管内皮细胞功能障碍之后ICAM-1表达可能会更高[10]。

HIF-1α是机体适应氧损伤的重要转录调节因子，缺氧是HIF-1α表达的经典刺激因素。但非缺氧因素也能刺激HIF-1α的表达，其中细胞因子是最重要的非缺氧调节因素[11]。 糖尿病血清培养后RF/6A细胞表达HIF-1α蛋白，可能和血清中这些细胞因子有关。本实验结果显示，在糖尿病状态下，HIF-1α能调节血管内皮细胞表面ICAM-1的表达水平。已有研究显示HIF-1α的表达与 VEGF呈正相关[12]，VEGF表达降低时，ICAM水平随之降低。本实验在使用反义寡核苷酸技术抑制了细胞HIF-1α表达后，糖尿病血清刺激诱导血管内皮细胞表面ICAM-1表达被抑制，HIF-1α可能通过直接和间接两种途径调节ICAM-1的表达。

本研究通过细胞实验证实，在糖尿病血清培养条件下，HIF-1α具有调控ICAM-1表达的作用，它有可能成为治疗早期DR的一个新的靶点。

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(收稿：2016-12-05)

The mediation of HIF-1to the expression of ICAM-1 by RF/6A in diabetic condition

Tian Bingyu,Song Huping.

Department of Ophthalmology,Xi’an No.4 Hospital(Xi’an 710004)

Objective: To investigate the mediation of HIF-1to the expression of ICAM-1 by retinal vascular endothelial cell under early stage of diabetic retinopathy condition. Methods:The rhesus choroid-retina vascular endothelial cell line RF/6A were cultured in RPMI 1640 medium-10% human serum, which was collected from the subjects of early stage of diabetic retinopathy and age-matched healthy control. The cells were cultured in 4 groups as control group(group A),diabetic group (group B), HIF-1anti-sense oligonucleotides (ASODN) group (group C) and HIF-1sense oligonucleotides (SODN) group (group D). ICAM-1 levels in RF/6A supernatants were determined with ELISA kit. Results: Contrast to group A, the level of ICAM-1 significantly increased in group B (25.26±1.97) ng/ml vs (13.89±1.35 )ng/ml(P=0.00). But after HIF-1bioactivity was blocked (group C), the effect on the level of ICAM-1 by diabetic serum(group B) was suppressed significantly (25.26±1.97) ng/ml in group B(16.59±1.11) ng/ml in group C vs (25.26±1.97)ng/ml in group B(P=0.00). Conclusion: In vitro, HIF-1could regulate the expression of ICAM-1 by RF/6A. HIF-1may served as a therapeutic target for the treatment and/or prevention of early diabetic retinopathy.

Diabetic retinopathy/physiopathology Inflammation Hypoxia-inducible factor-1 alpha/analysis Intercellular adhesion molecule-1/analysis Endothelium,Vascular

*陕西省自然科学基金资助项目(2011JM4048)西安市科技发展计划项目[SF1315(2)]

糖尿病视网膜病变/病理生理学 炎症 缺氧诱导因子1，亚单位/分析 细胞间粘附分子/分析 内皮，血管

R363.2

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.07.009

△通讯作者