王高振，金 朵，吴文君，祁志军

(西北农林科技大学 植物保护学院农药研究所，陕西杨凌 712100)

东方粘虫 U6启动子的克隆及功能验证

王高振，金 朵，吴文君，祁志军

(西北农林科技大学 植物保护学院农药研究所，陕西杨凌 712100)

为了持续获得大量短片段干扰RNA(short interference RNA, siRNA)，通过染色体步移技术克隆得到东方粘虫 U6 snRNA 基因5′-端侧翼启动子序列1 426 bp。经生物信息学分析，该序列含SPH元件、八聚体序列(OCT)、远端序列元件(DSE)、近端序列元件(PSE)及TATA box等RNA聚合酶Ⅲ(RNA polymerase Ⅲ，RNA Pol Ⅲ) U6启动子的特征元件。通过构建RNA干扰(RNA interference, RNAi)载体的方式，对增强型绿色荧光蛋白EGFP基因进行RNAi，证明克隆得到的东方粘虫 U6启动子可成功驱动shEGFP表达，具有 U6启动子功能。为后续构建以东方粘虫V-ATP酶H亚基为靶基因的沉默载体奠定基础。

东方粘虫；RNA干扰； U6启动子；功能验证

RNA干扰(RNA interference, RNAi)是近年来快速发展起来的一种序列特异的转录后基因沉默技术[1]，在功能基因组研究[2-3]、疾病防治[4-5]及新药研发[6-7]等方面具有广阔的应用前景。其基本原理是短片段干扰RNA(short interference RNA, siRNA)与细胞内同源的mRNA结合导致其降解，从而使目的基因表达沉默[8]。获得siRNA的方法主要有化学合成法、Dice酶切割法和短片段发卡RNA(short-hairpin RNA, shRNA)表达载体法[9]等。其中，构建shRNA表达载体的方法是唯一适合长期研究的方法，而且由于质粒可以复制扩增，相比起化学合成来说，能够显著降低制备siRNA的成本[10]。目前，介导siRNA表达的启动子主要是RNA聚合酶Ⅲ(RNA polymerase Ⅲ, RNA pol Ⅲ)启动子，常用人源和鼠源的 U6启动子及人的H1启动子等[11]。这类启动子可以促进快速合成大量shRNA，可以实现对细胞内基因的快速沉默[12]。……