李 婷，潘 登，范奎奎，李海军, 曹贵方, 杜晨光,*

（1.内蒙古农业大学兽医学院，内蒙古呼和浩特 010018；2.内蒙古农业大学职业技术学院，内蒙古包头 014109）

MC4R在小鼠下丘脑的定位及其基因在发情周期下丘脑、卵巢中的表达变化

李 婷1，潘 登1，范奎奎2，李海军1, 曹贵方1, 杜晨光1,2*

（1.内蒙古农业大学兽医学院，内蒙古呼和浩特 010018；2.内蒙古农业大学职业技术学院，内蒙古包头 014109）

黑素皮质素受体-4 (Melanocortin-4 Receptor，MC4R) 在参与调节摄食行为和机体能量平衡中发挥重要作用，但其在生殖活动中的作用尚不明确。为此本实验以不同发情周期中的C57小鼠为对象，利用免疫荧光对MC4R神经元在下丘脑的表达进行定位。通过Western Blot确定MC4R在小鼠发情前期、发情期、发情后期和间情期的下丘脑和卵巢中蛋白表达变化。结果表明：MC4R神经元广泛分布于下丘脑第三脑室，发情期下丘脑中MC4R蛋白表达量显著低于其他3个时期（P＜0.05）；同时期卵巢中MC4R蛋白表达量显著低于发情前期和发情后期（P＜0.05），发情后期MC4R蛋白表达量极显著高于其他3个时期（P＜0.01）。这一结果阐明了小鼠在发情周期不同阶段下丘脑和卵巢组织中MC4R的表达变化规律，为进一步研究MC4R在小鼠生殖活动中的作用提供理论基础。

MC4R；发情周期；下丘脑；卵巢

Huszar等[1]首次利用基因敲除实验证明了MC4R基因缺失的小鼠表现食欲旺盛、肥胖等症状，提出了MC4R是参与调控能量平衡的关键信号物质。Cui等[2]采用GFP转基因小鼠确定MC4R神经元主要分布在下丘脑外侧区（Lateral Hypothalamic Area, LHA），其功能体现为发挥相应采食及能量代谢平衡作用。有研究表明，MC4R亦参与动物的生殖调控活动。Sndrock等[3]证明MC4R基因敲除小鼠的卵巢黄体率显著性低于野生型鼠，同时MC4R还参与了调控黄体周期性变化[4]。生殖活动作为动物机体代谢的特殊活动形式，与能量代谢密不可分；MC4R的发现对理解能量平衡与生殖活动之间的关系具有重要意义，有必要重新认识MC4R在生殖活动中的作用。

卵巢作为雌性动物的性腺，主要受下丘脑和垂体调控进而发挥其正常的生殖功能，下丘脑含有的内分泌腺的释放因子可调节垂体促性腺激素的分泌。而卵巢功能的反馈作用，对下丘脑也会产生积极影响。因此，本实验以MC4R在C57小鼠下丘脑及卵巢上的表达为切入点，利用阴道涂片的方法确定其发情周期，测定4个时期的下丘脑、卵巢2种不同组织中MC4R蛋白变化情况，分析MC4R神经元在下丘脑的特异性分布情况，为了解MC4R在发情周期不同阶段下丘脑及卵巢中的作用奠定理论基础。

1 材料方法

1.1 C57小鼠下丘脑及卵巢组织的获取与保存 采用阴道涂片法确定小鼠发情周期[5]。发情前期涂片观察全部为有核上皮细胞，偶有少量角化细胞；发情期全部是无核角化细胞或间有少量上皮细胞；发情后期均有白细胞、角化细胞、有核上皮细胞；间情期有大量白细胞及少量上皮细胞和黏膜。分别选取不同发情阶段的小鼠。脱臼处死后冰上分离小鼠的下丘脑和卵巢，直接冻存于-80℃备用。

1.2 Western Blot 将小鼠的下丘脑、卵巢组织液氮彻底研磨，在研碎的组织中加入200 μL PIPA裂解液（PIPA:PMSF=99:1），将其置于冰上用电动马达再次彻底研磨，进行超声破碎处理。12 000 r/min离心10 min，收集上清。将所得蛋白用BCA法测定蛋白浓度，每个蛋白样浓度一致为2.3 μg/μL。用5%的浓缩胶、12%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶分离所提蛋白。湿转80 min后封闭1h。加入一抗MC4R抗体4℃过夜孵育，以GAPDH表达水平作为内参照。洗膜后加入荧光二抗，室温孵育1 h，于Odyessy扫描仪扫描结果。8 mL一抗稀释液加入一、二抗比例信息见表1。二抗抗体来源于美国Abcam公司。

表1 抗体信息

1.3 免疫荧光 用新鲜配制的4%多聚甲醛（pH 7.4）对小鼠进行灌注。取其下丘脑放于4%多聚甲醛内4℃固定6～8 h，并将固定好的组织放于30%蔗糖溶液内4℃脱水。OCT对组织进行包埋，置于冰冻切片机上切片，切片厚度为30 μm。0.02 mol/L PBS 4℃过夜贮存。用0.4%TritonX-100进行组织通透，封闭1 h。在一抗稀释液中加入一抗：Rabbit anti-MC4R, ab24233, 1:500，美国Abcam公司，4℃过夜孵育一抗。在二抗稀释液中加入二抗：Donkey Anti-Rabbit Alexa 647，1:800，美国Abcam公司，孵育1 h。将组织切片置于载玻片上贴片，过夜干燥，激光共聚焦显微镜（Nikon C2）下扫描组片。

1.4 统计分析 用统计学软件GraphPad Prism 5.0对数据进行单因子方差（One-Way ANOVA）分析统计。每个处理设3个重复，每个重复3次，测定结果以平均值±标准差表示，数据间比较采用t检验，显著性情况在图中相应位置标注。

2 结 果

2.1 MC4R神经元在下丘脑分布 由图1可知，MC4R广泛表达于C57小鼠第三脑室（3V）附近，且集中分布于下丘脑弓状核（Arcuate Nucleus，ARC）、腹内侧核（ Ventromedial Hypothalamic Nucleus，VMH）、室旁核（Paraventricular Nucleus，PVN）等区域。

2.2 MC4R蛋白在小鼠发情周期下丘脑的变化Western blot结果表明，MC4R蛋白在小鼠下丘脑和卵巢均有表达，处于发情期时下丘脑组织中MC4R表达量显著低于其他3个发情时期（P＜0.05）。发情前期、发情后期和间情期MC4R的表达无显著性变化（P＞0.05）（图2）。

图1 MC4R在小鼠下丘脑的表达分布结果

图2 发情周期MC4R蛋白在下丘脑中的蛋白表达变化

2.3 MC4R蛋白在小鼠发情周期卵巢的变化 小鼠处于发情期时，卵巢组织中的MC4R表达量显著低于发情前期和发情后期（P＜0.05），与间情期相比无显著性变化（P＞0.05）。发情前期与间情期MC4R无显著性变化。发情后期MC4R的表达量极显著高于其他3个发情时期（P＜0.01）（图3）。

图2 发情周期MC4R蛋白在下丘脑中的蛋白表达变化

3 讨 论

MC4R是中枢神经系统对调节能量代谢发挥重要作用的黑素皮质素受体之一[6]。下丘脑作为神经内分泌系统的关键枢纽，在调控采食及能量代谢平衡的过程中发挥重要作用。目前，已有对哺乳动物脑内MC4R分布的研究报道证实MC4R在下丘脑中表达，Cui等[2]采用GFP转基因小鼠确定MC4R神经元主要分布于LHA。Liu等[7]利用GFP转基因小鼠检测到MC4R神经元在PVH内分布密度最高。本文通过免疫荧光技术直接检测到MC4R神经元在下丘脑第三脑室周围广泛表达，且主要分布于ARC、VMH、PVN区域。本研究与前人的研究显示，小鼠下丘脑MC4R分布的神经核团不仅调节动物的采食，而且是含有促黄体激素释放激素（LHRH）、促性腺激素释放激素（GnRH）等多种与生殖有关激素的主要核团，它们参与动物生殖活动的调控[8]。另外，MC4R可以增加GnRH神经元内动作电位[9]，而GnRH可刺激垂体促性腺激素的分泌，进而影响动物的生殖活动；过表达MC4R的拮抗剂AgRP在导致动物机体肥胖的同时还会使机体产生不孕症状[10]。研究显示，MC4R与生殖活动之间存在必不可少的联系。

本研究结果表明，MC4R在小鼠下丘脑和卵巢组织中的蛋白表达分布与发情周期的变化有着密切的关系，发情后期卵巢对下丘脑可能存在负反馈调节作用，其他3个时期下丘脑对卵巢存在正向调控。发情周期作为雌性动物生殖发育中的一个重要过程，从神经内分泌角度讲，受3个基本部位分泌作用的调控：下丘脑的肽能神经元、垂体前叶的促性腺物质和位于卵巢的类固醇分泌细胞。其中，起主要作用的是下丘脑周期性释放GnRH，表现为循环中FSH、LH、雌激素的变化[11]。有报道指出，血清高浓度的雌激素水平出现在发情期。本研究结果显示，处于发情期的MC4R在小鼠下丘脑和卵巢表达量均最低，此现象与血清中雌激素含量呈负相关，推测MC4R对血清中雌激素含量有下调作用。

下丘脑是哺乳动物内分泌调节的皮下调控中枢，与垂体、卵巢组成下丘脑-垂体-卵巢（Hypothalamus-pituitary-ovary，HPO）轴，调节及维持雌性动物的正常生殖功能。Smith等[12]研究表明，下丘脑-垂体-性腺（Hypothalamicpituitary- gonad，HPG）轴对能量代谢很敏感，能量的变化会引起其功能的调整，从而导致激素分泌的变化。而雌激素的分泌主要受下丘脑-垂体-性腺轴的调节。因此，作为能量代谢的关键信号，MC4R可能通过HPO轴调节雌激素的分泌，从而完成对整个发情周期的调控。

4 结 论

本实验得出MC4R基因在小鼠发情周期不同阶段的下丘脑和卵巢中呈规律性变化，发情期下丘脑、卵巢中MC4R蛋白表达量均最低。MC4R神经元在下丘脑三脑室附近的广泛分布及其基因与小鼠发情周期的相关性，揭示了能量代谢与生殖之间的内在联系，为进一步研究MC4R在卵巢中的作用提供依据。

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Localization and Expression of MC4R in Mouse Hypothalamus and Ovary during Estrous Cycle

LI Ting1, PAN Deng1, FAN Kui-kui2, LI Hai-jun1, CAO Gui-fang1, DU Chen-guang1,2*
(1. College oVeterinary Medicine, Inner Mongolia Agricultural University, Inner Mongolia Hohhot 010018, China; 2. Vocational and Technical College, Inner Mongolia Agricultural University, Inner Mongolia Baotou 014109, China)

Melanocortin-4 receptor (MC4R) plays an important role ineeding behavior and body weight regulation, While itsunction in reproductive activities is not clear. So, we used C57 mice in dierent estrus cycles to locate MC4R by immunouorescence technique. Western blot was used to determine the expression omelanocortin-4 receptor protein in the proestrus, estrus, metestrus and diestrus omouse hypothalamus and ovary. The results showed, MC4R were widely distributed in the third ventricle othe hypothalamus. The expression oMC4R in the estrus ohypothalamus was signicantly lower than that in the other three periods (P ＜0.05). Meanwhile, the expression oMC4R in the ovaries was signicantly lower than that in the proestrus and diestrus (P ＜0.01), and the MC4R was signicantly higher in the diestrus (P ＜0.01) than in the other three periods. The results showed that the changes oMC4R expression in hypothalamus and ovary tissue in dierent stages oestrus cycle, which would provide a theoretical basisorurther study oMC4R in mouse reproductive activity.

MC4R; Estrous Cycle; Hypothalamus; Ovary

S865.1+30.3

：A

：10.19556/j.0258-7033.2017-07-025

2016-10-31；

2016-11-26

国家自然科学基金（31160455）；内蒙古自然科学基金（2014MS0323）；中国博士后科学基金（2013M541212）作者简介：李婷（1990-），女，硕士，主要研究方向为动物组织与胚胎发育生物学，E-mail：lt_5029@sina.com

* 通讯作者：杜晨光（1976-），男，教授，博士，研究方向为动物组织与胚胎发育生物学，E-mail： dcglxj@163.com