兴桂华 柏青杨 弓 箭 丛 欢 董海影

(齐齐哈尔医学院临床病理诊断中心，黑龙江 齐齐哈尔 161006)

·基础研究·

NAPP/PS1双转基因小鼠行为学表现及远志皂苷对其调控作用

兴桂华 柏青杨 弓 箭 丛 欢 董海影

(齐齐哈尔医学院临床病理诊断中心，黑龙江 齐齐哈尔 161006)

目的 观察APP/PS1双转基因小鼠记忆功能障碍的行为学表现和远志皂苷对其学习记忆能力的保护作用。方法 将3月龄APP/PS1双转基因小鼠随机分为模型组、盐酸多奈哌齐组、TEN低、中、高剂量组(18.5、37、74 mg·kg-1·d-1)，选同月龄C57BL/6小鼠为对照组。采用Morris水迷宫法和新物体识别试验检测小鼠的学习记忆能力，采用实时定量PCR及Western印迹方法检测海马神经元Bcl-2、Bax和Caspase-3表达水平。结果 与模型组相比，TEN各剂量组小鼠学习记忆能力明显改善(P<0.05)；与模型组相比，TEN各剂量组Bax和Caspase-3表达水平明显下降(P<0.05)，而Bcl-2表达水平显著升高(P<0.05)。结论 TEN可改善小鼠的学习记忆功能，其途径可能是通过上调Bcl-2表达，下调Bax表达，调节Bcl-2/Bax的平衡比值，降低Caspase-3表达来实现。

远志皂苷；APP/PS1双转基因；学习记忆

阿尔茨海默病(AD)临床主要表现为进行性记忆、学习和认知能力的丧失，主要病理特征为大脑皮层和海马区的老年斑沉积，神经原纤维缠结和大量神经元的丧失等。在AD的发生发展过程中，凋亡是其神经元死亡的主要形式〔1〕，神经细胞过度凋亡是造成神经元丢失的主要原因。远志皂苷(TEN)是益智健脑中药远志中的主要活性成分，现代药理研究表明其具有改善记忆、抗氧化、抗衰老和抗痴呆等作用〔2～4〕。本实验旨在探讨TEN改善AD小鼠学习记忆能力的可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验药品 TEN由南京景竹生物科技有限公司提供(CAS：JZ20160327A)，经HPLC测定纯度≥98%；盐酸多奈哌齐由卫材(中国)药业有限公司制造，产品批号110917A。

1.2 动物 APP/PS1双转基因小鼠(南京生物医药研究院，编号D000268)，3月龄雄性，50只；C57BL/6J小鼠，3月龄，雄性，10只。饲养于齐齐哈尔医学院实验动物中心SPF级饲养室。

1.3 主要试剂及仪器 YBR®ExScriptTMRT-PCR kit(Perfect Real Time)为TAKARA公司产品，RNAiso Reagent为TAKARA公司产品，DEPC为瑞兴化学产品。Bcl-2、Bax及Caspase-3多克隆抗体购于美国Santa Cruz公司，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG抗体购于北京博奥森生物技术公司。2700型PCR System扩增仪为Applied Biosystems公司产品。ABI7300荧光定量PCR仪为美国ABI公司产品。

1.4 方法

1.4.1 动物分组 APP/PS1双转基因小鼠经适应性饲养1 w后完全随机分组为模型组、盐酸多奈哌齐组(0.33 mg/kg)，TEN低、中、高剂量组(18.5、37、74 mg/kg)，选同月龄C57BL/6小鼠为对照组，对照组和模型组给予等体积的生理盐水灌胃，1次/d，连续灌胃90 d。

1.4.2 Morris水迷宫实验 给药结束后进行Morris水迷宫行为测试。水迷宫为一直径150 cm，高60 cm的不锈钢圆形水池，内置有机玻璃平台，平台高40 cm，底面为6 cm×10 cm。在东、西、南、北水池壁部位分别标明入水点。将平台放在西南象限正中距池壁22 cm处，迷宫中含牛奶液面高于安全平台1 cm，池内水温(22±1)℃，水中加入奶粉使水呈乳白色以防动物看到水下平台，训练期间环境安静，迷宫外参照物不变。

Morris水迷宫实验前5 d为定位航行试验：每天将小鼠从东入水点头朝池壁放入水池，4次/d。训练时随机选择1个入水点，将小鼠面向池壁放入水中，每次训练间隔为60 s。由顶部的红外摄像头记录小鼠找到水下平台的时间(逃避潜伏期)、游泳距离和轨迹，设定2 min为最长逃避潜伏期，2 min后自动停止记录。实验第6天为空间探索试验：定位航行试验结束后将水下平台撤除，在同一入水点将大鼠面向池壁放入水中，让大鼠在无平台情况下寻找记忆中的平台，记录在2 min内跨过原平台位置的次数。

1.4.3 新物体识别实验 检测箱由黑色聚酯塑料材质构成的60 cm×40 cm×80 cm的封闭箱，箱左右内侧壁镶嵌LED灯条，顶部悬挂摄像头观察动物的活动情况及探索过程。

实验检测过程分为适应期、熟悉期和测试期3个阶段，(1)适应期：每天将小鼠依次放入检测箱内，熟悉环境10 min为期3 d；(2)熟悉期：第4天，将两个完全相同的正方体红色积木块放入检测箱内对称的位置处，两个积木距离箱侧壁与箱后壁的距离均为10 cm，将小鼠放入熟悉5 min；(3)测试期：间隔30 min后将其中一个红色积木替换为大小相近的绿色圆柱形积木，将小鼠放入检测箱内，记录5 min内小鼠对新颖物体即绿色圆柱形积木(TN)和红色正方体即熟悉物体(TF)的探索时间，以小鼠鼻尖距被识别物体的距离不超过2 cm或用鼻子接触到被识别物体为探究行为。应用认知指数(RI)来评价动物的学习记忆能力，计算公式为RI=TN/(TN+TF)×100%。

1.4.4 实时定量PCR检测小鼠海马组织Bcl-2、Bax及Caspase-3的mRNA表达 按RNAiso Reagent操作说明书提取小鼠海马组织总RNA，紫外分光光度计分析后用琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的纯度、浓度及完整性。逆转录反应：逆转录反应在2700型PCR System扩增仪上进行，按SYBR®ExScriptTMRT-PCR Kit转录反应试剂盒方法操作，反应参数如下：反转录反应42℃ 15 min，反转录酶失活反应95℃ 2 min。PCR反应：PCR反应采用SYBR Premix Ex Taq(Perfect Real Time) kit试剂。引物由TaKaRa公司设计合成，引物序列如下：Bcl-2：上游引物序列为5′-TGA ACC GGC ATC TGC ACA C-3′；下游引物序列为5′-CGT CTT CAG AGA CAG CCA GGA G-3′。Bax：上游引物序列为5′-AGA CAC CTG AGC TGA CCT TGG AG-3′；下游引物序列为5′-GTT GAA GTT GCCATCAGCAAACA-3′；Caspase-3：上游引物序列为5-GAGACAGACAGTGGAACTGACGATG-3，下游引物序列为5-GGCGCAAAGTGACTGGATGA-3。GAPDH：上游引物序列为5′-GAC AAC TTT GGC ATC GTG GA-3′；下游引物序列为5′-ATG CAG GGA TGA TGT TCT GG-3′。反应条件如下：预变性，95℃，10 s (1个循环)。PCR反应，95℃，5 s；60℃，31 s(40个循环)。反应结束后，使用Sequence Detection software version1.2.3软件(Applied Biosystems公司)分析PCR过程个检测样本的Ct(Threshold cycle)值。

1.4.5 Western印迹检测小鼠海马组织Bcl-2、Bax及Caspase-3蛋白表达 取每组小鼠各5只，待行为学测试结束后，迅速将小鼠断头取出脑组织进行总蛋白的提取，采用BCA法对样品蛋白质浓度进行检测，取出蛋白质50 μg加入2×SDS凝胶加样缓冲液中，放置在水浴锅中煮沸5 min以致使蛋白质变性，经10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳2 h分离样品。在70 mA恒流状态下使胶中蛋白质4℃冰箱过夜，之后经电泳转移至硝酸纤维素膜上，在5%脱脂奶粉中37℃封闭2 h。加入Bax、Bcl-2和Caspase-3一抗，4℃冰箱过夜。加入二抗37℃孵育，摇振2 h。利用Western印迹荧光发光检测试剂盒发光、显影、定影。晾干、拍照并进行图像分析。在Western印迹分析中，分别以对照组Bcl-2、Bax和Caspase-3杂交带的积分光密度值为相对值，其他各组杂交带的积分光密度值均与对照组杂交带的积分光密度值相比，最后得出相对值。为了避免不同批次杂交的条件差异所致显色长短不一的误差，故采用相对值进行半定量分析各组的表达量。

1.5 统计学方法 采用SPSS19.0软件对数据进行统计学分析，数据的组间比较行t检验。

2 结 果

2.1 TEN对APP/PS1 双转基因小鼠学习记忆能力的影响

2.1.1 Morris水迷宫实验结果 第5天定位航行实验检测发现，与对照组相比模型组小鼠在第三象限停留时间(RTQ)与跨越隐匿平台的次数明显减少，而逃逸潜伏期延长，入水朝向角度明显增加(均P<0.05)；与模型组相比，盐酸多奈哌齐组和TEN 各剂量组的RTQ与跨越隐匿平台的次数明显增加，逃逸潜伏期均明显缩短，入水朝向角度明显减小(均P<0.05)。见表1，图1。

表1 各组小鼠空间学习记忆能力

与对照组比较:1)P<0.05；与模型组比较:2)P<0.05；下表同

图1 各组小鼠定位航线实验轨迹图

2.1.2 新物体识别实验检测结果 与对照组〔(75.94±19.59)%〕相比，模型组小鼠RI〔(47.04±10.77)%〕显著降低(P<0.05)；与模型组相比，盐酸多奈哌齐组〔(69.49±17.25)%〕和TEN 高剂量组〔(68.87±13.11)%〕明显增加(P<0.05)。另外低剂量组为(60.72±19.84)%，中剂量组为(65.45±15.06)%。

2.2 TEN对APP/PS1 双转基因小鼠Bcl-2、Bax和Caspase-3 mRNA表达的影响 与对照组比较，模型组Bax和Caspase-3 mRNA的表达明显升高，而Bcl-2 mRNA 表达明显降低(均P<0.05)；与模型组比较，盐酸多奈哌齐组和TEN各剂量组Bax和Caspase-3 mRNA表达均明显降低且Bcl-2 mRNA表达呈现升高趋势(P<0.05)。见表2。

2.3 TEN对APP/PS1 双转基因小鼠Bcl-2、Bax和Caspase-3 蛋白表达的影响 与对照组比较，模型组Bax和Caspase-3蛋白表达明显升高(P<0.05)，而Bcl-2蛋白表达明显降低(P<0.05)；与模型组比较，TEN各剂量组Bax和Caspase-3的蛋白表达均明显降低且Bcl-2蛋白表达呈现升高趋势(均P<0.05)。见表2、图2。

表2 TEN对APP/PS1 双转基因小鼠Bcl-2、Bax和Caspase-3 mRNA和蛋白表达的影响

A：对照组；B：模型组；C：盐酸多奈哌齐组；D：TEN 低剂量组；E：TEN中剂量组；F：TEN高剂量组图2 Bax、Bcl-2和Caspase-3的Western印迹检测结果

3 讨 论

AD是一种神经退行性疾病，病理特征为老年斑、神经原纤维缠结及神经元变性或凋亡，其行为学改变表现为学习记忆功能障碍和进行性痴呆等。学习记忆障碍是AD主要临床症状和特征，因此对学习记忆进行评价是观察AD模型及药物治疗效果的重要指标之一〔5〕。Morris水迷宫实验是一种让实验动物学习寻找不透明水中隐藏平台的过程，主要应用于检测大鼠空间学习记忆功能，是国内外公认的检测大鼠空间学习记忆理想而有效的测试方法〔6〕。应用于AD 研究的动物模型很多，APP/PS1双转基因小鼠模型能够较好的模拟AD 患者的早期病理和行为特征，是目前国内外比较公认的AD转基因动物模型之一〔7，8〕。本实验结果表明经90 d 的TEN治疗能够改善AD模型小鼠的空间学习记忆能力，同时经过TEN治疗后转基因小鼠能够记住站台的位置，空间记忆能力明显提高。物体识别实验是一种评价动物非空间工作识记忆能力的简单灵敏的方法〔9〕。

现已证实，AD神经细胞凋亡与Bcl-2基因家族关系密切，其中Bax是一种重要的促进细胞凋亡的基因，Bax蛋白作为线粒体膜上离子通道的组成成分使Cyt-c得以穿过线粒体膜，Cyt-c的释放可看作是凋亡途径中的始动因素，其促使Caspase-9被激活，在凋亡途径中具有重要作用〔10〕。Bcl-2 具有抑制细胞凋亡的作用，通过干扰Cyt-c 的释放而阻断上游Caspase 蛋白酶的激活，抑制细胞的凋亡〔11〕。正常情况下Bcl-2和Bax在细胞内保持平衡状态，二者表达蛋白水平的相对比例是凋亡发生的决定性因素。因此，Bcl-2和Bax基因或蛋白常可作为研究凋亡的特征性指标。当Bcl-2的过度表达可与Bax构成异源二聚体而抑制细胞凋亡，Bax过量时形成Bax-Bax同源二聚体也可促进细胞凋亡。Caspase 家族是哺乳动物细胞凋亡的启动者和执行者，与Bcl-2 家族基因共同参与了线粒体介导的内源性细胞凋亡途径，其中 Caspase-3是介导细胞凋亡的核心、最关键的凋亡蛋白酶〔12〕。细胞凋亡早期时凋亡信号可激活 Caspase-3，而激活Caspase-3后可使细胞核、细胞质及细胞骨架的参与凋亡所必需的重要蛋白质降解失活〔13，14〕。

TEN是益智健脑中药远志中的主要活性成分，现代药理研究表明其具有改善记忆、抗氧化、抗衰老和抗痴呆等作用。本实验结果表明，TEN对APP/PS1 双转基因小鼠学习记忆障碍有较好的改善作用，其机制可能是TEN上调Bcl-2蛋白表达，下调Bax蛋白表达，调节Bcl-2 /Bax 的平衡比值，使线粒体结构得以保护，进而阻止Cyt-c 经线粒体间隙外漏到细胞质内，阻抑Caspase-3启动凋亡级联瀑布反应发生，从而阻断内源性细胞凋亡通路，最终发挥其抗细胞凋亡作用。

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〔2017-01-16修回〕

(编辑 郭 菁/滕欣航)

国家自然科学基金青年基金项目(No.81403131)

董海影(1982-)，女，博士，讲师，主要从事神经精神疾病的病理学研究。

兴桂华(1969-)，女，硕士，教授，主要从事病理学研究。

R745.1

A

1005-9202(2017)13-3121-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.13.001