周 灿，王一鸣，林 馨，王永华

（浙江中医药大学医学技术学院，浙江杭州 310053）

川芎嗪对庆大霉素耳毒性的抗氧化作用研究

周 灿，王一鸣，林 馨，王永华

（浙江中医药大学医学技术学院，浙江杭州 310053）

为了观察川芎嗪(TMP)对庆大霉素（GM）耳毒性豚鼠氧自由基生成的影响，探讨TMP对GM耳毒性损伤的保护作用。选取豚鼠作为实验动物，将豚鼠随机分为4组：正常对照组、GM组、GM+TMP组和TMP组。检测豚鼠血清中超氧化物歧化酶（SOD）和一氧化氮合酶（NOS）活性、一氧化氮（NO）和丙二醛（MDA）含量，并结合听性脑干反应（ABR）测试和耳蜗HE染色技术。结果表明：GM+TMP组血清SOD活性明显高于GM组（P<0.05），MDA含量较GM组明显减少（P<0.001），NOS活性和NO含量明显低于GM组（P<0.05），且听功能明显改善；耳蜗形态学改变与听力变化一致。TMP在一定程度上可以有效防护GM所致的耳蜗损伤，其机制可能与清除活性氧物质、抑制脂质过氧化反应的发生有关。

川芎嗪；庆大霉素；自由基；耳蜗

氨基糖苷类抗生素（aminoglycoside antibiotics，AmAn）在临床应用时会引起严重的耳毒性，目前多认为AmAn诱导耳蜗产生过量的氧自由基，突破细胞内抗氧化系统的防御能力，从而导致细胞的死亡或凋亡[1]。川芎嗪（tetramethylpyrazine，TMP）是活血化瘀类中药川芎的有效成分，其基本化学结构为四甲基吡嗪，现已能人工合成，张兆辉等[2]发现TMP对活性氧自由基具有清除作用。本实验将TMP与庆大霉素（gentamicin，GM）作用于豚鼠后，通过检测豚鼠血清中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和一氧化氮合酶（nitric oxide synthse，NOS）活性，丙二醛（malondialdehyde，MDA）和一氧化氮（nitric oxide，NO）含量，以及观察听性脑干反应（auditory brainstem response，ABR）阈值和细胞形态学的变化，研究TMP对氧自由基的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物分组及庆大霉素豚鼠耳毒模型的建立

耳廓反射正常的红目白毛健康豚鼠，体重300 g，雌雄各半（动物由浙江中医药大学动物实验中心提供），随机分成4组。GM组（12只）：硫酸庆大霉素注射剂（浙江瑞新药业股份有限公司，批号：20121019）100 mg/kg，肌注，Bid；TMP组（8只）：注射用盐酸川芎嗪（哈尔滨三联药业有限公司，批号：120403A1）10 mg/kg，腹腔注射，qd；GM+TMP组（12只）：注射GM和TMP的剂量、注射方法同上；正常对照组（8只）：氯化钠注射液等量注射。连续用药12 d，每天秤体重以调整药量。

1.2 豚鼠ABR检测

用药前及最后一次用药24 h后检测双耳ABR阈值。豚鼠用戊巴比妥钠40 mg/kg腹腔注射麻醉后，在屏蔽隔声室内常规测试ABR。采用美国ICS公司ICS-CHARTR型诱发电位检测仪，记录电极置于前额正中皮下，地极置于鼻根部，参考电极置于耳后乳突部皮下，选择合适耳塞，插入式耳机插入豚鼠外耳道。刺激声信号为短声（click）带通滤波100～3 000 Hz，扫描时间10 ms，叠加1 024次，重复率21.1次/s，刺激声强由80 dB nHL开始，以5 dB逐次递减，降至反应波消失，记录Ⅲ波阈值。

1.3 耳蜗组织石蜡切片制备和HE染色

检测各组豚鼠ABR后，立即断头，速取双侧听泡，打开听泡分离出耳蜗，开放圆窗和前庭窗，微针挑开蜗顶后，从蜗顶小孔处缓慢灌入4%多聚甲醛固定液，将耳蜗标本浸入4℃该固定液中充分固定24 h以上，4℃下脱钙4周，常规石蜡包埋后行4 μm连续切片，再行HE染色。

1.4 豚鼠血清SOD、NOS活性和MDA、NO含量检测

检测ABR后，分别腹腔取血、离心，取血清-20°C冻存，采用SOD、NOS、NO、MDA试剂盒（南京建成生物工程研究所），按说明操作检测。

1.5 统计学处理

采用SPSS17统计软件进行实验数据分析，结果以均数±标准差（±S）表示，用独立样本t检验和单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TMP对GM耳中毒豚鼠ABR阈值的影响

各组豚鼠在用药前后ABR阈值的变化见表1。各组用药前ABR阈值无显著差异（P>0.05），连续用药12 d后，GM组ABR阈值比用药前明显升高（P<0.05），与正常对照组比较有明显差异（P<0.05）；GM+TMP组ABR阈值虽然在用药后也有所升高，但较GM组明显降低（P<0.01）；TMP组与正常对照组ABR阈值在用药前后无明显差异（P>0.05）。

表1 各组用药前后豚鼠 ABR阈值（dB nHL,±S）Tab.1 The ABR threshold of guinea pigs before and after treatment

表1 各组用药前后豚鼠 ABR阈值（dB nHL,±S）Tab.1 The ABR threshold of guinea pigs before and after treatment

注：与用药前比，*P<0.05；用药后，与对照组比，△P<0.05；与GM组比，▲P<0.01.

组别 耳数 click ABR阈值用药前 用药后对照组GM组GM+TMP组TMP组8 12 12 8 9.37±4.03 10.00±4.47 11.67±3.53 10.00±4.33 5.77±6.07 76.47±13.20△*24.16±3.76▲△*7.69±4.84▲

2.2 豚鼠耳蜗HE染色细胞形态观察

光镜下正常对照组耳蜗底转Corti器结构完整，毛细胞形态正常，排列整齐，无缺失，细胞膜光滑；GM组Corti器毛细胞减少，有较多缺失，呈现水肿状态；GM+TMP组Corti器毛细胞散在缺失，呈现空泡化，但较GM组损伤轻；TMP组Corti器毛细胞结构基本完整（图1）。

光镜下正常对照组螺旋神经节细胞形态正常，排列密集，细胞核边界清晰；GM组螺旋神经节细胞间隙增大，有空泡变性，侧壁的小血管扩张，内红细胞增多；GM+TM组螺旋神经节细胞形态结构均有不同程度改变，细胞数量有所减少，但较GM组轻。TMP组螺旋神经节细胞的形态结构变化较轻，细胞核致密且染色深，核膜边界清晰，细胞排列较密集（图2）。

图1 各组豚鼠耳蜗Corti器（HE×200）Fig.1 Guinea pig cochlea Corti organ(HE×200)

图2 各组豚鼠耳蜗螺旋神经节细胞（HE×200）Fig.2 Guinea pig cochlear spiral ganglion cells(HE×200)

2.3 豚鼠血清中SOD、NOS活性及MDA、NO含量

用药后，GM组血清中SOD活性下降，MDA含量明显升高，与正常对照组比较有差异（P<0.05，P<0.01）；GM+TMP组血清SOD活性显著高于GM组（P<0.05），MDA含量明显低于GM组（P<0.001）。GM组血清NOS活性显著增强，NO含量显著增高，与正常对照组比较差异显著（P<0.01，P<0.05）；GM+TMP组血清NOS活性和NO含量明显低于GM组（P<0.05）。TMP组与正常对照组相比无显著性差异（表2）。

表2 各组用药后豚鼠血清SOD、NOS活性和MDA、NO含量（±S，n=40）Tab.2 The activity of SOD,NOS and MDA and NO in serum of guinea pigs after treatment

表2 各组用药后豚鼠血清SOD、NOS活性和MDA、NO含量（±S，n=40）Tab.2 The activity of SOD,NOS and MDA and NO in serum of guinea pigs after treatment

注：*由XRD结果，通过Scherrer公式XRD谱图中Ni（111）晶面半峰宽计算金属Ni粒径.

组别 SOD/U·mL-1 MDA/nmol·mL-1 NOS/U·mL-1 NO/umol·mL-1对照组GM组GM+TMP组TMP组122.89±7.30 114.22±5.76△130.35±10.64☆128.13±6.23﹡4.68±1.02 8.38±0.76※5.69±1.33﹡3.88±0.65﹡14.31±1.33 16.80±0.89※13.60±2.05☆13.75±1.30﹡87.19±19.21 118.94±22.56△89.64±13.20☆85.03±6.00☆

3 讨论

AmAn耳毒作用机制之一为自由基学说。已有研究表明GM通过与游离铁离子形成复合物，催化产生了自由基，自由基可通过生物膜中不饱和脂肪酸的过氧化导致生物膜形态和功能的改变，从而引起细胞坏死或凋亡，并因此形成脂质过氧化物如MDA。MDA可带着原自由基的损伤潜能从其生成部位如内质网扩散到线粒体、核糖体、细胞核等部位，造成进一步严重损害[3]。AmAn还可激活内耳组织中，NOS，催化生成NO水平增高。过量的NO会产生病理性损伤，干扰细胞的能量代谢，还可导致过氧亚硝基阴离子形成，作用于酶、脂质、蛋白质及DNA等大分子物质，产生更大的细胞毒性作用，使细胞损伤或死亡[1]。正常情况下,耳蜗中存在着自由基清除系统，其中以SOD活性较高，SOD对机体的氧化与抗氧化平衡起着关键作用，它可以清除超氧阴离子自由基，保护毛细胞免受损伤。SOD活性的检测可间接反映耳蜗在GM耳毒性时清除氧自由基的能力。

TMP是从伞形科蒿本属植物川芎的根茎中提取的主要化学成分。TMP具有多种药理作用，临床上被广泛用于心、脑血管、肺、肝、肾等疾病的治疗。由于该药具有解除血管痉挛、改善微循环、保护血管内皮细胞等作用,故常用于耳科突发性耳聋、老年性聋等感音神经性聋的治疗。研究发现TMP对心、脑缺血再灌注损伤具有保护性，与其能提高SOD活性，增强氧自由基的清除、抑制脂质过氧化反应有关[4]。韩明等[5]研究证实，TMP可提高顺铂中毒豚鼠耳蜗SOD活性，明显降低MDA含量，从而减轻氧化应激反应，对顺铂耳毒性具有防护作用。崔城等[6]的研究显示，TMP可降低GM中毒耳蜗NOS活性，减轻GM耳毒性。孔敏等[7]的实验结果表明，TMP可以通过减少应用顺铂时耳蜗内NOS的表达，从而对抗顺铂的耳蜗毒性。

本实验血清学检测结果表明，GM组用药后SOD活力低于对照组，NOS活性、NO和MDA含量明显高于对照组；GM+TMP组SOD活力明显高于GM组，NOS活性、NO和MDA含量低于GM组。GM+TMP组用药后的ABR阈值与对照组相比虽有所升高，但与GM组相比明显降低，且与SOD活力增高、NOS活性减弱、NO和MDA含量减少相关；在光镜镜下观察到GM+TMP组耳蜗毛细胞和螺旋神经节细胞的损伤较GM组明显减轻。表明TMP能有效提高SOD活力，抑制脂质过氧化反应，并可能通过抑制NOS活性的异常增高，减少NO的过量生成，从而减少自由基生成，保护耳蜗组织免受GM的毒性破坏，改善听功能。我们在实验中也观察到，TMP组与正常对照组的NOS活性、NO含量及ABR阈值无显著差异，表明川芎嗪注射液对正常豚鼠耳蜗NO的生成无明显影响，证实了川芎嗪注射液的安全无毒。

从以上结果可以看出，TMP可通过提高耳蜗SOD活力，抑制NOS活性，抑制脂质过氧化反应，减少氧自由基的过量生成，从而保护耳蜗毛细胞，改善听功能，这可能也是TMP对GM耳毒性损伤的保护机制之一。

[1]SHA Suhua,SCHACHT J.Antioxidants attenuate gentamicin-induced free radicals Formation in vitro and ototoxicity in vivo:D-methionine is a potential protectant[J].Hearing Research,2000,142(1/2):34-40.

[2]张兆辉,卫涛涛,余绍租,等.川芎嗪的抗氧化机制对缺性脑损伤的保护作用[J].中国临床康复,2004,34(8):7 742-7 744.

[3]FORGE A,LI Lin.Apoptotic death of hair cells in mammalian vestibular sensory epithelia[J].Hearing Research,2000,139(1/2):97-115.

[4]QIAN Weidong,XIONG Xingjiang,FANG Zhuyuan,et a1.Protective effect of tetramethylpyrazine on myocardial isehemiareperfusion injury[J/OL].Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine,http://dx.doi.org/10.1155/2014/107501

[5]韩 明,程 鑫,程秀臻,等.川芎嗪对顺铂耳中毒诱导型一氧化氮合酶表达的影响[J].中国康复理论与实践,2008,14(4):343-344.

[6]崔 城,汤 浩,崔桂英,等.川芎嗪拮抗庆大霉素耳毒性作用的实验研究[J].现代康复,2001,5(2):53-54.

[7]孔 敏,刘儒林.川芎嗪对顺铂所致耳蜗毒性保护作用的实验研究[J].潍坊医学院学报,2010,32(4):253-255.

Study on Antioxidation Effect of Tetramethylpyrazine on Gentamicin Ototoxicity

ZHOU Can,WANG Yi-ming,LIN Xin,et al
(Department of Hearing,Zhejiang University of Traditional Chinese Medicine,Hangzhou 310053,China)

To observe the effect of tetramethylpyrazine(TMP)on the oxygen free radicals of gentamicin(GM)ototoxicity in guinea pig,and to explore the protective effect on the toxicity of GM.Guinea pigs were used as experimental animals and randomly assigned 4 groups:control group,GM-treated alone,GM and TMP in combination and TMP-treated alone.Serum levels of superoxide dismutase(SOD),nitric oxide synthase(NOS),nitric oxide(NO)and maIondiaIdehyde(MDA)in guinea pig were measured,combined with auditory brainstem response(ABR)test and cochlear HE staining.The results showed that SOD level in serum of the GM+TMP group was much higher than that in the GM group(P<0.05),MDA concentration was significantIy lower than that in the GM group(P<0.001),NOS level and NO concentration were significantly lower than those in the GM group (P<0.05),ABR thresholds were significant lower than that in the GM group(P<0.01),and cochlear morphology is consistent with hearing changes.TMP can effectively reduce the effects of ototoxicitycaused by GM to a certain degree,and its mechanism may be explained by the fact that TMP can clean out the oxygen free radicals and inhibit oxidative response caused by GM.

tetramethylpyrazine;gentamicin;oxygen free radicals;cochlea

R285.5

：A

2016-12-14

浙江省教育厅科研项目（Y201017253）

周灿（1994-），男，贵州大方人，研究方向：耳聋康复.

王一鸣，研究方向：中医药耳聋防治.E-mail:924866694@qq.com

1008－830X(2017)01－0086－05