齐琦+张配+李其响+潘琼+郑海伦+赵素容

[摘要] 冬凌草甲素是从中药冬凌草Rabdosia rubescens中分离得到的一种贝壳杉烯二萜类的天然有机化合物，具有抗炎、抗菌、抗肿瘤等多种生物活性。该实验观察冬凌草甲素对三阴乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡的影响及其可能的作用机制。采用MTT法检测冬凌草甲素对MDA-MB-231细胞的增殖抑制作用，PI单染、Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术分析冬凌草甲素对MDA-MB-231细胞凋亡的影响，活性氧（ROS）试剂盒检测细胞内ROS水平的变化，Western blot分析PARP，Bcl-2，caspase-3蛋白的表达情况。结果表明，冬凌草甲素对乳腺癌MDA-MB-231细胞具有明显的凋亡诱导作用，显著升高细胞内的ROS水平，下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，并促进caspase-3及其底物PARP的切割。提示，冬凌草甲素诱导MDA-MB-231细胞凋亡的作用可能与升高细胞内ROS水平、下调Bcl-2的表达以及激活caspase-3相关。

[关键词] 乳腺癌； 冬凌草甲素； 细胞凋亡； 活性氧

[Abstract] Oridonin， which is an ent-kaurene diterpenoid isolated from traditional Chinese medicine Rabdosia rubescens， displays various bioactivities， including anti-inflammation， anti-bacteria and anti-tumor. This study aimed to investigate the effect of oridonin on apoptosis of triple-negative breast cancer MDA-MB-231 cells and its underlying mechanisms. The inhibitory effect of oridonin on proliferation of MDA-MB-231 cells was measured by MTT assay； Apoptosis was analyzed by flow cytometry with PI staining and Annexin V-FITC/PI staining； Intracellular reactive oxygen species （ROS） level was determined by ROS detection kit， and expressions of PARP， Bcl-2， caspase-3 were analyzed by Western blot. The results showed that oridonin exhibited a significant effect in inducing apoptosis of MDA-MB-231 cells， enhancing intracellular ROS level， down-regulating expression of Bcl-2 protein， and promoting cleavage of caspase-3 and its substrate PARP. These results indicated that the apoptosis-inducing effect of oridonin on MDA-MB-231 cells might be correlated with increase of intracellular ROS level， down-regulation of Bcl-2 protein and activation of caspase-3.

[Key words] breast cancer； oridonin； apoptosis； reactive oxygen

乳腺癌是世界范圍内严重危害女性健康与生命的恶性肿瘤，其发病率呈逐年增长的趋势。近年来尽管其治疗取得了长足的进步，但乳腺癌在发展中国家的发病率依然快速增长[1]。目前，外科手术、放疗和化疗是乳腺癌最主要的治疗手段。雌激素受体、孕激素受体、人类表皮生长因子受体2（HER2）均为阴性表达的乳腺癌，为三阴性乳腺癌（TNBC），该亚型的乳腺癌占乳腺癌病例数的12%～24%[2]。TNBC具有恶性程度高、侵袭性强、预后差等特征，并对内分泌治疗和抗HER2的靶向治疗均不敏感[3-4]。因此，寻找新的作用机制的治疗药物对TNBC的治疗具有重要意义。

冬凌草甲素是从中药冬凌草Rabdosia rubescens中分离得到的一种贝壳杉烯二萜类的天然有机化合物，具有抗炎、抗菌、抗肿瘤等多种生物活性[5]。其中，抗肿瘤作用的研究受到了广泛关注，研究发现，冬凌草甲素对肺癌、结肠癌、胰腺癌等显示了良好的抗肿瘤效应[6-8]，且毒副作用较低，尚未见对骨髓、肝脏、肾脏、心脏等重要脏器有明显损伤作用的报道。该化合物以其显著的抗肿瘤活性及低毒副作用等优势，显示了作为新型抗肿瘤药物或辅助抗肿瘤药物的应用前景[9-10]。但冬凌草甲素抗肿瘤作用的具体机制并不明确。近年来，有研究表明某些化疗药物或化合物可通过升高肿瘤细胞内活性氧（ROS）水平杀伤肿瘤细胞[11-12]。本实验将从ROS出发，探讨冬凌草甲素诱导三阴乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡的作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞株 人乳腺癌MDA-MB-231细胞购自中国科学院上海细胞库。于含10%胎牛血清的DMEM培养液中，5%CO₂细胞培养箱中常规培养。

1.2 试剂 DMEM培养液（Hyclone公司）；胎牛血清（Gibco公司）；冬凌草甲素（Merck公司），以二甲基亚砜（DMSO）溶解；MTT，PI（Sigma公司）；Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒（索莱宝公司）；ROS探针DCFH-DA，0.25%胰蛋白酶（碧云天生物技术研究所）；PARP，Bcl-2抗体（Santa Cruz公司）；caspase-3抗体（Abcam公司）；β-actin，HRP标记的山羊抗兔IgG（博士德公司）。

1.3 细胞存活率测定 96孔细胞培养板中每孔接种6×10³个MDA-MB-231细胞，细胞贴壁后更换新的培养液，加入不同浓度（10，20，30，40，50 μmol·L^-1）冬凌草甲素处理细胞，同时设不加药物的对照组（加入等体积的培养液及溶剂DMSO）和空白对照组，每组3个重复。药物处理48 h后每孔加入15 μL MTT液继续培养4 h，弃上清，每孔加入150 μL DMSO，结晶充分溶解后用酶标仪测定570 nm处吸光度A。

细胞存活率=（A实验组-A空白组）/（A对照组-A空白组）×100%

1.4 Annexin V-FITC/PI染色法检测细胞早期凋亡 6孔细胞培养板中每孔接种3×10⁵个细胞，细胞贴壁后换液加入含20，30，40 μmol·L^-1冬凌草甲素的新培养液，设置不加药物的对照组，每個处理3个重复。药物作用24 h后收集细胞，调整细胞密度为5×10⁵～1×10⁶个/mL，取1 mL细胞，1 000 r·min^-1离心10 min，弃上清，用PBS洗涤细胞2次。将细胞重悬于500 μL结合缓冲液中，每个样品中加入5 μL Annexin V-FITC，混匀，室温避光孵育15 min，上机前5 min加入5 μL PI，混匀，1 h内上流式细胞仪检测。

1.5 PI染色法检测总的细胞凋亡率 6孔细胞培养板中每孔接种3×10⁵个细胞，细胞贴壁后更换新的培养液，加入20，30，40 μmol·L^-1冬凌草甲素处理细胞，设置不加药物的对照组，每个处理3个重复。药物处理48 h后胰酶消化收集细胞，PBS洗涤，75%冷乙醇-20 ℃固定过夜。测试前用PBS洗涤2次，将细胞重悬于300 μL PI液中，室温避光反应30 min，上流式细胞仪分析具有subG₀/G1期DNA含量的细胞比例。

1.6 细胞内ROS检测 6孔细胞培养板中每孔接种3×10⁵个细胞，细胞贴壁后更换新的培养液，加入20，30，40 μmol·L^-1冬凌草甲素处理细胞，设置不加药物的对照组，每个处理3个重复。药物作用5 h后收集细胞，加入含10 μmol·L^-1 DCFH-DA的无血清培养液，37 ℃避光孵育20 min，用无血清培养液洗涤细胞3次，以充分去掉未进入细胞内的DCFH-DA，上流式细胞仪检测DCF的荧光强度。

1.7 Western blot检测凋亡相关蛋白的表达 接种细胞于6孔细胞培养板中，5×10⁵个/孔，培养24 h后换液加入含20，30，40 μmol·L^-1冬凌草甲素的新培养液，设置不加药物的对照组。药物处理24 h后胰酶消化收集细胞，PBS洗2次，每处理组细胞加入50 μL蛋白裂解液，冰上裂解30 min，提取总蛋白，以牛血清白蛋白为标准采用BCA法测定各处理组的蛋白浓度。每处理组取50 μg蛋白进行12% SDS-PAGE垂直电泳；蛋白采用湿法转膜至PVDF膜；Western封闭液室温封闭2～3 h；一抗室温孵育1～3 h或4 ℃过夜；二抗室温孵育1 h；ECL发光试剂盒显影；Bio-Rad 凝胶成像仪曝光获取图像。

1.8 统计学处理 采用SPSS 19.0统计软件对实验数据进行方差分析，组间差异比较采用LSD检验，当P<0.05时差异有统计学意义。

2 结果

2.1 冬凌草甲素对乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖的影响 MTT实验结果表明，与对照组相比，10～50 μmol·L^-1冬凌草甲素能明显抑制MDA-MB-231细胞的增殖，随着药物浓度增加其抑制作用越强（图1）。

2.2 冬凌草甲素对乳腺癌MDA-MB-231细胞早期凋亡的影响 冬凌草甲素作用MDA-MB-231细胞24 h可诱导其发生早期凋亡。对照组细胞的早期凋亡率为（1.5±0.9）%，药物处理组的细胞早期凋亡率随着冬凌草甲素浓度的增加而升高，20，30，40 μmol·L^-1冬凌草甲素组的细胞早期凋亡率分别为（9.3±1.7）%，（15.4±2.1）%，（26.9±3.0）%，相比于对照组有显著性差异（P<0.01）。

2.3 冬凌草甲素对乳腺癌MDA-MB-231细胞总的细胞凋亡的影响 浓度为20，30，40 μmol·L^-1的冬凌草甲素处理MDA-MB-231细胞48 h，收集细胞，PI染色流式细胞术检测总的细胞凋亡情况。结果显示，对照组的总的细胞凋亡率为（1.3±0.6）%，20，30，40 μmol·L^-1的冬凌草甲素可诱导乳腺癌细胞发生显著的细胞凋亡，总的细胞凋亡率分别为（19.4±2.7）%，（39.7±2.8）%，（50.5±3.2）%，与对照组相比有显著性差异（P<0.01）。

2.4 冬凌草甲素对乳腺癌MDA-MB-231细胞内ROS水平的影响 浓度为20，30，40 μmol·L^-1的冬凌草甲素处理MDA-MB-231细胞5 h，收集细胞，流式细胞仪测定细胞内ROS水平的变化。结果表明，与对照组相比，冬凌草甲素能显著升高细胞内ROS水平，随着药物浓度增加其升高ROS的作用越强（图2）。

2.5 冬凌草甲素对乳腺癌MDA-MB-231细胞PARP，Bcl-2，caspase-3蛋白表达的影响 浓度为20，30，40 μmol·L^-1的冬凌草甲素处理MDA-MB-231细胞24 h，采用Western blot观察凋亡相关蛋白PARP，Bcl-2，caspase-3的表达情况。结果显示，冬凌草甲素处理乳腺癌细胞后可下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，促进caspase-3及其底物PARP的切割（图3）。

3 讨论

ROS依据其分子类型的不同可分为非离子型和离子型，包括过氧化氢、羟自由基、超氧阴离子自由基、单线态氧、烷过氧化自由基、脂过氧化自由基等。细胞内氧化还原状态的平衡对于细胞的存活及功能至关重要，低水平的ROS在维持细胞内稳态中发挥了重要作用[13]。研究表明，在肿瘤的发生发展进程中，细胞内的氧化还原状态通常发生异常变化，引起肿瘤细胞内ROS水平的升高[14]。升高的ROS不仅使肿瘤细胞更易于发生基因突变，且使肿瘤细胞对异常升高的ROS较正常细胞更为敏感[15]。许多抗肿瘤化合物可通过升高细胞内ROS诱导肿瘤细胞发生凋亡[16-17]。通过调节Bcl-2蛋白家族的磷酸化和泛素化，ROS可上调促凋亡蛋白的表达、下调抗凋亡蛋白的表达，进而诱导细胞凋亡[18]。Hildeman等报道，细胞内ROS的升高可通过下调Bcl-2蛋白的表达引起线粒体膜电位的下降，从而诱发细胞凋亡[19]。本实验以DCFH-DA为细胞内ROS探針，检测到冬凌草甲素可升高MDA-MB-231细胞内ROS水平，同时Western blot实验结果显示冬凌草甲素可下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，提示其可能通过升高细胞内ROS而下调Bcl-2的表达参与细胞凋亡的诱导。

细胞凋亡是受死亡信号调节并伴随天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶（caspases）活化的一种自主而有序的细胞死亡形式，是多基因严格调控的过程[20]。Bcl-2蛋白家族在细胞凋亡过程中起着关键性作用，分为抗凋亡成员和促凋亡成员两大类，前者包括Bcl-2，Bcl-XL，Mcl-1等，可保护线粒体膜的完整性；后者包括Bax，Bak，Bad等，可促使多种凋亡诱导因子的释放，通过激活caspases触发细胞凋亡[21]。caspases蛋白酶家族在细胞凋亡过程中发挥着重要作用，其中caspase-3是介导细胞凋亡的关键分子，该分子被上游信号Bcl-2等激活后可引发酶促级联反应，通过切割其底物核蛋白PARP，导致细胞凋亡的发生[22]。本实验中，冬凌草甲素处理MDA-MB-231细胞24 h，可下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，并引发caspase-3和PARP的切割，提示冬凌草甲素可能通过提高线粒体膜的通透性、激活caspase-3而诱导细胞凋亡。

本实验结果表明，冬凌草甲素可诱导MDA-MB-231细胞凋亡，其机制可能与升高细胞内ROS水平、下调Bcl-2的表达并激活caspase-3相关，但ROS下调Bcl-2表达的分子机制尚需进一步研究。

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[責任编辑 张宁宁]