张楷承+曹雨诞+姚芳+张丽+丁安伟

[摘要] 采用模式生物斑马鱼的胚胎评价京大戟醋制前后各提取物急性毒性，同时以大戟二烯醇为对照品测定了各提取物的总萜含量。选取24 h发育正常的斑马鱼胚胎，每个提取物设8个浓度和一个空白对照组，并观察给药后96 h斑马鱼胚胎的发育和死亡情况，计算不同样品对斑马鱼胚胎的半数致死浓度（LC₅₀）。结果显示对于斑马鱼胚胎，京大戟醋制前后各提取物均有急性毒性，与生品相比，醋制后毒性显著降低。不同提取方式中，醇提物毒性大于水提物；不同极性部位中毒性大小依次为石油醚>二氯甲烷>乙酸乙酯>正丁醇、剩余部位。结合萜类成分含量测定结果可推测萜类成分为京大戟主要毒性成分，且其毒性大小与萜类成分的含量呈正相关。表明斑马鱼胚胎模型适用于京大戟毒性评价，为进一步认识与评价京大戟的毒性成分及醋制减毒的作用机制提供合适的研究方法以及理论依据。

[关键词] 京大戟； 醋制； 斑马鱼胚胎； 急性毒性； 总萜含量

[Abstract] The embryos of model organism zebrafish were used to evaluate the acute toxicity of the extracts of Euphorbiae Pekinensis Radix and vinegar-processing Euphorbiae Pekinensis Radix， and the total terpene content of each extract was determined by using euphol as the reference standards. Twenty-four h normally developed zebrafish embryos were chosen， and 8 concentrations were adopted for each extract. Then the growth and death of zebrafish embryos were observed at 96 h after administration， and median lethal concentrations （LC₅₀） of the different samples on zebrafish embryos were calculated. The results showed that all of the extracts （before and after vinegar processing） had acute toxicity on zebrafish embryos. The toxicity of vinegar-processing Euphorbiae Pekinensis Radix was significantly lower than that of crude Euphorbiae Pekinensis Radix. Among different extraction methods， ethanol extract was more poisonous than water extract； in different polarity fractions， the toxicity was in the following order： petroleum ether>dichloromethane>ethyl acetate>n-butyl alcohol and remaining part. Combined with the results of the determination of terpene components， it can be concluded that the terpenoids are the main toxic components of Euphorbiae Pekinensis Radix， positively correlated with toxicity degree. It indicates that the zebrafish embryo model is appropriate for the toxicity evaluation of Euphorbiae Pekinensis Radix and provides appropriate research methods and theoretical basis for the further study of the toxic components and the mechanism of reducing toxicity.

[Key words] Euphorbiae Pekinensis Radix； processing with vinegar； zebrafish； acute toxicity； content of total terpene

斑馬鱼Barchydanio rerio，为鲤科Danio属，最早产于孟加拉、印度等地。因其与人类基因具有高度同源性，在蛋白质水平上其关键部位的同源性几乎是100%，且各个器官如肝、肠、肾等都与人类极为相似，故可用斑马鱼模拟人类很多疾病[1-2]，作为一种新兴的模式生物，斑马鱼有着低成本、易饲养、易于给药与观察、实验动物数量多、重复性好等优点，近年来已经发展成为全球公认的医学和毒理学动物模型 [3-5]，且斑马鱼胚胎毒性研究已经延伸到了中药领域，并取得了喜人成果[6-9]。

京大戟为大戟科Euphorbiaceace大戟属Euphorbia植物大戟E. pekinensis Rupr.的干燥根[10]，始载于《神农本草经》，列为下品，为中医常用的峻下逐水药，常用于水肿胀满、胸腹积水等症[11]。因其药性苦寒有毒，故临床多使用其醋制品，但现代研究尚不能明确阐述京大戟醋制减毒的原理[12]。经毒性实验表明，醋制后京大戟的药性缓和，刺激性毒性显著降低[13]，现代化学成分研究发现，京大戟主要含有萜类等化学成分[14]。现有报道多以小鼠、细胞等手段探究京大戟的毒性，本课题组前期研究表明京大戟对于小鼠肝、胃、肠均有一定的毒性[15-16]，但动物实验成本较高、时间较长、药物用量大、不易重复；中医药理论强调用药的整体作用，而体外细胞实验不能够完全模拟生物体内环境且实验条件要求较高，与整体动物相比较为局限和片面。故本文拟以模式生物斑马鱼胚胎对京大戟醋制前后不同提取物进行毒性研究，同时测定各提取物中总萜的含量，以期对京大戟醋制减毒的物质基础研究提供依据。

1 材料

1.1 药材

京大戟购于广西（20160616），经南京中医药大学吴啟南教授鉴定为大戟科植物京大戟E. pekinensis的块根。

1.2 动物

实验用鱼为野生型AB品系斑马鱼[体长（3.5±0.3） cm，体重（0.45±0.1） g]，购于南京尧顺禹生物科技有限公司，约7月龄，斑马鱼成鱼在（28.5±0.5） ℃的水中自然交配繁殖鱼卵，养殖与繁殖方法参照zebrafish book[17]。

1.3 仪器与试剂

桌上型连续投料粉碎机（AH-8111型，北京鑫环亚科技有限公司）；体式显微镜（SZX41型，上海明兹精密仪器有限公司）；智能生化培养箱（宁波海曙赛福实验仪器厂），UV-2401可见紫外分光光度计（岛津公司）；电热鼓风干燥箱；旋转蒸发仪（BUCHI公司）；电子天平（梅特勒MS-105DV，1/10 万）；超声波清洗仪（KH-500型，昆山禾创超声仪器有限公司）；人工海水（蒸馏水，NaCl 13.7 mmol·L^-1，KCl 5.4 mmol·L^-1，Na₂HPO₄0.25 mmol·L^-1，KH₂PO₄0.44 mmol·L^-1，CaCl₂1.3 mmol·L^-1，MgSO₄1.0 mmol·L^-1，NaHCO₃4.2 mmol·L^-1）；DMSO（批号2010307，分析纯，南京化学试剂有限公司）；大戟二烯醇（实验室自制，纯度大于98%）；香草醛（阿拉丁试剂有限公司，质量分数为99%，批號43885）；冰醋酸（批号20160415，分析纯，太仓沪试试剂有限公司）；高氯酸（批号20150606，优级纯，上海金鹿化工有限公司）；甲醇（批号170765，色谱纯，江苏汉邦科技有限公司）。

2 方法

2.1 样品的制备

2.1.1 生京大戟的制备 取京大戟药材，除去杂质，洗净，加水润透，切厚片，干燥即为生京大戟饮片。

2.1.2 醋京大戟的制备 据《中国药典》2015年版[11]，取净生京大戟（SJDJ）1 kg加食醋300 g，闷润2 h，加水稀释至1 500 mL，闷润2 h，文火煮沸至醋吸净，取出，凉至六七成干，40 ℃减压干燥8 h，得京大戟醋制品（CJDJ）。

2.1.3 生京大戟各溶剂提取物的制备 称取京大戟生品50 g，洗净，粉碎过4号筛，以10倍量乙醇回流提取2次，每次2 h，回收乙醇至无醇味，得到京大戟生品醇提浸膏（SCT），得率为12.91%。同样按照上述方法，制备京大戟生品水提物得率为59.36%[用10倍量水回流提取2次，浓缩得到京大戟生品水提浸膏（SST）]。

醋京大戟各提取物的制备方法同上。醇提物（CCT）得率为13.06%，水提物（CST）为45.12%。

2.1.4 生京大戟不同提取部位的制备 称取京大戟生品500 g，洗净，粉碎过筛4号，以10倍量95%乙醇回流提取2次，每次2 h，回收乙醇得京大戟生品醇浸膏，将浸膏用水悬浮，依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取并回收溶剂得以上4个部位以及剩余部位。得率分别为石油醚（SPet）2.49%、二氯甲烷（SE）1.18%、乙酸乙酯（SY）4.59%、正丁醇（SZ）2.59%、剩余（SS）1.49%。

醋京大戟不同部位的制备同上。各极性部位得率分别为石油醚（CPet）2.70%、二氯甲烷（CE）1.38%、乙酸乙酯（CY）3.06%、正丁醇（CZ）3.50%、剩余（CS）4.80%。

2.2 总萜类含量测定

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取大戟二烯醇对照品6.06 mg至50 mL量瓶中，加甲醇至刻度，混匀，即为大戟二烯醇对照品溶液。

2.2.2 供试品的制备 精密称取SCT 12.91 mg，CCT 13.06 mg，至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，混匀。SST 59.36 mg、CST 45.12 mg，至10 mL量瓶中，加蒸馏水溶解，混匀。分别取SPet，SE，SY，SZ，SS 10 mg，精密称定，置于100 mL量瓶中，加甲醇至刻度，混匀；醋品各极性部位供试品制备同上。

2.2.3 显色条件与吸收波长的确定 精密量取对照品对照品0.5 mL和SCT供试品0.25 mL于具塞试管中，置水浴锅挥干溶剂，加入0.5 mL新鲜配制的0.5%香草醛-冰醋酸溶液以及高氯酸0.6 mL，混匀后100 ℃水浴30 min，取出冷却后精密加入冰醋酸5 mL，摇匀即得待测样品溶液。以相应的试剂作为空白，在400～800 nm处进行扫描[18]。根据扫描结果，选用540 nm为测定波长。

2.2.4 线性关系考察 分别精密量取大戟二烯醇对照品溶液0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 mL，按照上述显色条件显色，同法制备空白溶液，参照分光光度法在540 nm处测定其吸光度。以样品吸光度（y）为纵坐标，大戟二烯醇的取样量（x，mg）为横坐标，进行线性回归。

2.2.5 精密度试验 取SCT供试品适量，按照上述条件显色后，与540 nm处连续测定6次，计算RSD。

2.2.6 重复性试验 精密量取6份SCT，每份0.25 mL，加入具塞试管中，显色后于540 nm处测定吸光度，计算RSD。

2.2.7 稳定性试验 精密量取SCT 0.25 mL，显色后每隔一段时间测定一次吸光度，共测定6次，计算RSD。

2.2.8 加样回收率试验 精密量取CPet部位供试品6份，每份1 mL，并向其中加入大戟二烯醇对照品溶液（0.121 2 g·L^-1）0.4 mL，水浴挥干溶剂后显色，于540 nm处测定其吸光度，计算平均回收率以及RSD。

2.3 斑马鱼毒性评价

2.3.1 斑马鱼胚胎繁殖及收集 需要产卵前一周提前将雌雄斑马鱼按照1∶2的比例分开喂养，产卵前一晚将其合并，捞入特制的产卵容器中，放入氧气泵以及加热棒，控制温度（28.5±0.5） ℃，第2天捞出成鱼，收集鱼卵，清洗并除去未受精的死卵以及粪便等杂物。鱼卵采用人工海水培养，于培养箱中培养24 h，挑取健康发育的受精卵用于实验。

2.3.2 DMSO对斑马鱼的急性毒性 由于斑马鱼胚胎无法口服给药，故需将样品溶解于培养胚胎的人工海水中，从而使得斑马鱼胚胎自主的从水中吸收待测药物。京大戟提取物中的萜类成分等不易溶于水，故实验中采用二甲基亚砜（DMSO）助溶，而DMSO也具有毒性，因此有必要对其毒性进行评价，从而消除DMSO对于实验的影响。

实验方法采用静水实验法，以96 h为1个试验周期。采用24孔板，每孔放入10枚健康斑马鱼胚胎，用滴管将孔中的水吸去，分别加入不同浓度（0.1%，0.2%，0.4%，0.8%，1%，2%，4%）的DMSO人工海水溶液2 mL，每个浓度设置1个平行组与1个人工海水对照组，给药后观察96 h内胚胎的发育以及死亡情况。得出DMSO对斑马鱼的中毒剂量。

2.3.3 预实验确定毒性范围 将京大戟醋制前后各提取物用人工海水溶解（如需助溶，则加入不超过0.5%DMSO），配制成浓度不同的一系列样品（不同提取方式各样品浓度均为所含生药量，各极性部位样品浓度均为浸膏浓度），加入放有10枚健康斑马鱼胚胎的24孔板中，每孔2 mL，每个浓度设置3个平行组与1个对照组，给药后每隔24 h观察并记录胚胎的发育及死亡情况，4 d后得出各提取物96 h的LC₁₀₀和LC₀。

2.3.4 LC₅₀的测定 将各供试品按照预实验给定的LC₁₀₀和LC₀的范围，在其中选定组间比例为0.8，按照几何级数梯度设8个实验浓度组以及1个人工海水对照组。每个浓度组设定3个平行组以及1个对照组。实验期间每24 h观察鱼卵的孵化及死亡情况并及时记录，整个实验周期结束后，将数据进行统计分析，计算京大戟各提取物对斑马鱼的半数致死浓度（LC₅₀）。

2.3.5 数据处理 实验结果采用 SPSS Statistics 20软件进行统计分析，数据用±s表示，以P<0.05为有显著性差异，P<0.01为有极显著性差异。

3 结果

3.1 京大戟总萜含量测定

3.1.1 方法学考察 线性关系考察中经过线性回归得回归方程y= 5.735x-0.020 2（r=0.999 5）。表明该方法线性关系良好；精密度实验中计算得RSD为0.30%，表明该方法精密度良好；重复性实验中计算得RSD为2.0%，表明该方法重复性良好；稳定性实验中计算得RSD为1.8%，表明样品稳定性良好，在12 h内保持稳定；加样回收率实验中计算得平均回收率为100.7%；RSD为1.5%。表明本方法准确可行。

3.1.2 京大戟醋制前后各樣品总萜含量测定 将京大戟各样品按照上述方法进行显色，得到样品溶液，测定吸光度后计算总萜含量，结果见表1。

3.2 DMSO对斑马鱼毒性实验

DMSO对斑马鱼急性毒性实验结果见表2，可见DMSO质量浓度在0.5%之内对斑马鱼96 h不产生急性毒性反应，可以安全使用。

3.3 各提取物对斑马鱼急性毒性预实验

经过预实验，得到京大戟醋制前后的不同提取物在96 h对斑马鱼胚胎的无死亡的最大剂量（LC₀）和全部死亡的最小剂量（LC₁₀₀），结果见表3。

预实验得到京大戟生醋不同溶剂提取部位对斑马鱼的LC₀和LC₁₀₀，结果见表4。

3.4 京大戟醋制前后不同提取物对斑马鱼胚胎96 h的LC₅₀

各组斑马鱼胚胎给药后，每隔24 h观察死亡情况并及时挑出死亡的胚胎，记录数据，96 h实验结束，统计死亡情况，计算得到各样品对斑马鱼的LC₅₀。结果表明，与生品相比，醋制后各提取物均有LC₅₀有明显升高（P<0.01），表明醋制后毒性显著减小；对于不同提取方式，生品与醋品的水提物毒性明显减小与醇提物；不同极性部位中，极性较小的石油醚、二氯甲烷部位毒性最强，其余部位的LC₅₀均有明显升高（P<0.01），可推测京大戟中极性较小的化合物毒性较大。京大戟醋制前后不同提取物LC₅₀的测定具体结果见表5，图1；不同极性部位结果见表6，图2。

x

3.5 京大戟醋制前后不同提取物对斑马鱼胚胎的量-毒关系

上述实验得到的不同浓度的京大戟生品醇提物对斑马鱼的毒性情况，以药液浓度 （mg·L^-1）为横坐标，斑马鱼的死亡率（%）为纵坐标绘图。可以得到京大戟醋制前后不同提取物的量-毒曲线，见图3。按照同样的方法得到京大戟醋制前后醇提物不同溶剂提取部位的量-毒曲线，见图4。结果表明京大戟醋制前后各提取物对斑马鱼胚胎均有明显的量毒关系。

4 讨论

京大戟作为常用有毒中药，因其苦寒有毒，醋制机制又尚不明确，一直以来严重制约其发展和临床使用。因此，运用现代科学手段阐述京大戟的毒性成分、作用机制以及醋制减毒的原理，成为了京大戟研究的重点。斑马鱼作为一种新的模式生物，比细胞以及小鼠等传统实验手段有其独特的优势，如高通量、低成本、易观察、给药量少、重复性好等[19-20]，本实验中使用斑马鱼胚胎对各提取物进行LC₅₀的测定，相比于小鼠，斑马鱼胚胎的数量较多，在数据基数大的情况下，实验结果相对更加稳定可靠，且大大节约了时间以及成本。李兴华等[21]采用小鼠测定京大戟生品不同提取物的LC₅₀，由于小鼠个体较大，耐受性较强，只能测定醇提物，而水提物急性毒性无法测出；对于不同极性部位，本文采用斑马鱼胚胎，毒性评价结果与王奎龙等[22]使用小鼠测定的毒性大小相一致，表明斑马鱼胚胎可以代替小鼠，更加方便快捷的对京大戟的毒性进行评价。同时在实验过程中，胚胎完全透明，可以在显微镜下观察其孵化以及发育情况，与空白组相比，给药组尤其是毒性较大的石油醚、二氯甲烷部位，胚胎发育明显迟缓，且表现出卵黄囊吸收延迟、肝脏以及胃腺肠道发育不良、血流速度减缓、心包水肿等症状，表明京大戟毒性成分对于斑马鱼胚胎有明显的发育毒性，且对肝、胃肠、心脏等均具有一定毒性，而后期研究京大戟毒性成分的作用部位以及作用机制时优势将更加明显。

综合斑马鱼毒性评价与含量测定2个方面的结果，可知京大戟中的毒性成分主要集中在石油醚、二氯甲烷部位，而且经过醋制，这2个部位中萜类成分的含量下降也最明显，因此可通过分离这2个部位中的化合物，来进一步确定京大戟中的毒性成分。京大戟在醋制过程中，加入了醋并且与水共煮，期间可能发生酸水解等其他化学反应，导致毒性成分化学结构发生改变，从而降低了毒性。故可采用醋酸酸水解等方法，将毒性成分进行转化并与醋京大戟成分进行比对，对醋制中成分转化的过程进行追踪，从而进一步阐明京大戟毒性的物质基础以及醋制减毒机制。同时也为以斑马鱼为动物模型进行生物活性导向分析毒性及有效成分提供新思路。

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[责任编辑 孔晶晶]