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维生素D对PDCD4表达的调控作用研究

2017-07-07饶泽兵张娜潘莹肖梦君吴俊仙陈允梓

东南大学学报(医学版) 2017年3期
关键词:培养皿炎症性调控

饶泽兵,张娜,潘莹,肖梦君,吴俊仙,陈允梓

(南京医科大学 基础医学院,江苏 南京 211166)

·论 著·

维生素D对PDCD4表达的调控作用研究

饶泽兵,张娜,潘莹,肖梦君,吴俊仙,陈允梓

(南京医科大学 基础医学院,江苏 南京 211166)

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

1.2.1 原代小鼠骨髓巨噬细胞(BMDMs)分离和培养 将处死的B57小鼠用75%酒精浸泡2~3 min,晾干酒精放在盘上,小鼠后肢的皮毛脱至足部,剪下后肢放在培养皿中,去除肌肉,用镊子提起股骨,在股骨大转子关节处剪下股骨,放入培养皿中,用1 ml注射器取生理盐水注入骨髓腔并冲洗2~3次,收集细胞,1 000 r·min-1离心5 min。再用含10%L929细胞培养上清的DMEM培养基重悬细胞并分到培养皿诱导分化。将其放入37 ℃、含5%CO2的培养箱培养过夜,收集培养上清,离心,用含10% L929细胞上清的培养基重悬细胞再铺回培养皿,隔天换液,培养至第7天,贴壁细胞为小鼠骨髓来源的巨噬细胞。

1.2.5 统计学处理 SPSS 17.0软件进行统计学分析,实验数据以均数±标准差表示,组间比较采用t检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 维生素D抑制PDCD4的mRNA表达

在BMDMs中,采用不同终浓度(0、2、20、200 nmol·L-1)的维生素D进行刺激,24 h后收获细胞,用实时定量PCR方法检测PDCD4的mRNA表达。结果显示,PDCD4 mRNA水平随着维生素D刺激浓度的升高而下降,变化差异具有统计学意义(P<0.05,P<0.001,n=3)(图1A)。再采用20 nmol·L-1维生素D刺激BMDMs,在不同时间点(0、8、16、24、32、48 h)检测,结果显示,PDCD4的mRNA表达水平与维生素D刺激时间呈负相关性,变化差异具有统计学意义(P<0.001,n=3)(图1B)。以上结果说明了PDCD4 mRNA水平受维生素D负调控,并表现为剂量依赖以及作用时间的负相关。

A.不同剂量维生素D刺激的BMDMs中PDCD4的mRNA水平;B.维生素刺激BMDMs,在不同时间点PDCD4的mRNA水平;aP<0.05,bP<0.01

图1 在原代BMDMs中,维生素D刺激对PDCD4 mRAN水平的影响

Fig 1 mRNA expression of PDCD4 with the stimuli of vitamin D in BMDMs

2.2 维生素D抑制PDCD4蛋白表达水平

为进一步确认维生素D对PDCD4的调控,我们采用免疫印迹法检测了PDCD4蛋白表达水平。实验结果如图2A,随着维生素D浓度(0、2、20、200 nmol·L-1)的增加,PDCD4蛋白表达水平呈下降趋势,表现为剂量依赖关系。同样,采用20 nmol·L-1维生素D刺激细胞不同时间(0、8、24、48、72 h)后,PDCD4的蛋白表达水平随着刺激时间延长而降低(图2B),与检测的mRNA水平结果吻合。综上所述,维生素D能够抑制PDCD4的蛋白表达。

A.不同剂量的维生素D刺激的BMDMs中PDCD4蛋白水平;B.维生素刺激BMDMs,在不同时间点PDCD4的蛋白水平

图2 维生素D刺激的BMDMs中PDCD4的蛋白表达水平

Fig 2 Protein expression of PDCD4 with the stimuli of vitamin D in BMDMs

2.4 在LPS炎症模型中维生素D对PDCD4表达的调控

为了更好地阐明维生素D的抗炎作用,我们采用LPS诱导炎症细胞模型。当细胞在LPS诱导条件下,采用维生素D进行共刺激,然后检测PDCD4的蛋白水平。结果如图4所示,与LPS单独刺激相比,LPS与VD共刺激能更显著地抑制PDCD4的表达,说明炎症情况下,维生素D能有效地抑制PDCD4的表达水平。

3 讨 论

图4 在LPS刺激的条件下,维生素D刺激的BMDMs中PDCD4的蛋白表达水平

Fig 4 Protein expression of PDCD4 with stimuli of LPS and vitamin D BMDMs

大量文献报道维生素D在炎症相关的疾病中发挥着重要的作用[1- 2]。维生素D作为一种激素,具有检测容易、易于补充和价格相对便宜等非常明显的特征和优势,因此研究其在炎症性疾病中的作用,将为预防、诊断和治疗炎症性疾病提供很大帮助。一系列的研究发现,在动脉粥样硬化[10]、心功能障碍[11]、糖尿病[12]等与炎症相关的疾病中,PDCD4发挥重要作用,是潜在的调控炎症性疾病的分子靶点。我们的研究表明,维生素D能够有效抑制PDCD4的表达,并且能够加强LPS对PDCD4的负调控,这将为深入了解维生素D在炎症性疾病中的作用机制提供有效帮助。

Study on vitamin D in regulating PDCD4 expression in BMDMs

(BasicMedicalCollegeofNanjingMedicalUniversity,Nanjing211166,China)

国家自然科学基金面上项目(81371759)

R965

A

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