刘广昌　陈红艳　杨永平　严海超　郭健　罗罡　刘凤玲

【摘要】 目的：利用双向荧光差异凝胶电泳-质谱分析技术，研究广东省原住口腔扁平苔藓患者非刺激全唾液蛋白丰度变化。方法：选取本院2016年1-12月收治的15例口腔扁平苔藓患者为研究组，15例正常者为对照组，收集两组患者的唾液，提取唾液的总蛋白，通过双向荧光差异凝胶电泳分离蛋白质，荧光扫描寻找差异蛋白质，利用质谱分析技术对差异蛋白质进行分析。结果：SDS-PAGE显示所有样品的蛋白条带清晰，无空缺条带，无明显蛋白丢失现象。经2-D DIGE分离检测，两组唾液蛋白样品的总蛋白整体分布相似，重复性较好，研究组与对照组平均唾液蛋白质点数分别为（1596±207）个和（1603±164）个。质谱分析鉴定两组唾液蛋白存在五个差异比较明显的蛋白质，即分泌性IgA、锌α2糖蛋白、碳酸酐酶6、唾液淀粉酶和血清白蛋白，且研究组唾液蛋白中分泌性IgA表达下调，其余四种差异蛋白均表達上调（P<0.01）。结论：分泌性IgA、锌α2糖蛋白、碳酸酐酶6、唾液淀粉酶和血清白蛋白五种差异蛋白，可能与口腔扁平苔藓的发生及发展密切相关，可为今后的药物选择与治疗方案制定提供依据。

【关键词】 口腔扁平苔藓； 唾液蛋白； 双向荧光差异凝胶电泳； 质谱分析

Non-stimulated Total Salivary Proteomics of Oral Lichen Planus in Guangdong Province/LIU Guang-chang，CHEN Hong-yan，YANG Yong-ping，et al//Medical Innovation of China，2017，14（16）：128-131

【Abstract】 Objective：To study the abundance change of non-stimulated total salivary protein in oral lichen planus patients in Guangdong province by two dimensional fluorescence difference gel electrophoresis（2-D DIGE）-mass spectrometry.Method：From July 2016 to December 2016，15 patients with oral lichen planus in our hospital were selected as the study group，15 normal subjects were selected as the control group. Saliva of the two groups was collected for the study.The total proteins of saliva were extracted and the proteins were separated by two-dimensional fluorescence differential gel electrophoresis.The differential proteins were detected by fluorescence scanning，and the differential proteins were analyzed by mass spectrometry.Result：SDS-PAGE showed that the protein bands of all the samples were clear and there was no vacancy band and no protein loss.The total protein distribution of the salivary protein samples was similar and reproducible by 2-D DIGE.The average number of salivary protein spots in the study group and control group were （1596±207） and （1603±164）cases respectively.Mass spectrometry analysis showed that there were five significant differences in salivary proteins，secreted IgA，zinc α-2-glycoprotein，carbonic anhydrase 6，salivary amylase and serum albumin.The expression of secretory IgA in the saliva protein of the study group was down-regulated， and the other four proteins were all up-regulated（P<0.01）.Conclusion：Five differentially expressed proteins，incliuding secretory IgA，zinc α-2-glycoprotein， carbonic anhydrase 6，salivary amylase and serum albumin，may be closely related to the development and progression of oral lichen planus，which can provide basis for future drug selection and treatment plan.

【Key words】 Oral lichen planus； Salivary protein； Two dimensional fluorescence difference gel electrophoresis（2D-DIGE）； Mass spectrometry

First-authors address：Dalang Hospital of Dongguan，Dongguan 523770，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.16.037

口腔扁平苔藓（OLP）是临床上一种常见的慢性口腔黏膜病，30～60岁为好发年龄，儿童和老人少见，女性略多于男性[1]。OLP可长期反复发作，因长期糜烂病损易导致癌变，世界卫生组织将其列入癌前状态[2]。OLP目前发病机制尚不明确，临床尚无特别有效的治疗方法。双向荧光差异凝胶电泳（2D-DIGE）技术，是利用电荷和分子量的差异分离蛋白质混合物，并通过多通道激光扫描分析不同蛋白质的第二向SDS-PAGE凝胶图像[3-4]。与以往的双向电泳技术相比，重复性好，灵敏度高。本研究采用双向荧光差异凝胶电泳-质谱分析技术，通过对本地区口腔扁平苔蘚患者唾液蛋白的筛选找出差异蛋白，为进一步研究本地区OLP的发病机制提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取本院2016年1月-2016年12月收治的15例口腔扁平苔藓患者为研究组，15例正常者为对照组，收集两组患者的非刺激性全唾液（whole nnstimulated saliva，WUS）。其中研究组男6例，女9例，平均年龄（42.5±3.4）岁。对照组男7例，女8例，平均年龄（43.1±2.6）岁。两组患者一般资料比较差异均无统计学意义（P>0.05），具有可比性。该研究已经医院伦理学委员会批准，入选患者知情同意。

1.2 纳入及排除标准 两组入选成员均为广东省原住人口；均全身无系统性疾病；口腔内均无其他黏膜病变及中、重度牙周炎；妇女均未处于怀孕期及哺乳期；半年内未做过牙周基础治疗；最近3个月均未服用过抗生素；均全口无龋者；均无抽烟者。

1.3 方法

1.3.1 仪器设备 Ettan等电聚焦电泳仪、Ettan垂直板电泳仪、MultiTem P Ⅲ温控循环水浴、Typhoon 9400多功能荧光扫描系统、Image Quant图像分析软件、Decyder Differentialin-gel Analysis V ersion 7.0凝胶分析软件均为GEHealthcare 公司产品，4800 M ALDI-TOF/TOF质谱为Applied Biosystem 公司产品

1.3.2 样本的采集 OLP患者在采集前一天晚餐清淡饮食，睡前采用Bass刷牙法进行口腔护理。所有成员均按照Rhodus改良的方法，采集WUS 3 mL置于无菌试管。收集所有样品后，吸取唾液上清液加入离心管中，随后加入新鲜配制50%胎牛血清白，迅速用封口膜密封，快速放入-80 ℃超低温冰箱中冷冻、备用。

1.3.3 样本的处理 将样本进行裂解、离心，并取上清液。得到蛋白溶液经2D-Clean up试剂盒纯化后用2D-Q uant试剂盒进行定量。每样品各取50 μg蛋白质，按照CyDye DIGE Fluor minimal labeling kit试剂盒使用说明进行荧光标记。

1.3.4 双向电泳（全程避光） 将用Cy2、Cy3和Cy5标记的样品混合在一支离心管，加入等体积的2×sample buffer，用移液器吸打混匀后避光、冰上放置10 min。加入一向电泳水化液至450 L，混匀。将上述溶液加入Holder中，小心置入24 cm胶条（pH 3～11），用覆盖油覆盖。等电聚焦参数设定为：30 V，12 h；100 V，1 h；1000 V，1 h；梯度升压至8000 V，2 h；电流控制在50 μA/胶条。等点聚焦后在平衡液1和平衡液2中各平衡15 min。用电泳液轻轻润洗胶条。然后转移到第二向已制好的12.5% SDS-PAG E胶上，用0.5%琼脂糖封顶，进行第二向电泳，二向电泳的参数设定为：3 W/胶条，45 min；17 W/胶条至溴酚蓝染料迁移至胶的底部结束电泳。

1.3.5 图像扫描 用Typhoon 9400荧光扫描仪分别采集Cy2、Cy3和Cy5荧光信号。通过调整PM T，使选定的强信号区域荧光强度在60000～100000并尽量接近，平衡荧光信号。所得图像用Decyder Differentialin-gel Analysis Version 7.0凝胶分析软件进行差异蛋白分析。

1.3.6 质谱分析 考马斯亮蓝后挖取感兴趣的差异蛋白质点置于离心管中，进一步用胰蛋白酶降解，进行MALDI-TOF/TOF质谱分析，通过Mascot数据搜索鉴定蛋白质。

1.4 统计学处理 采用SPSS 16.0软件进行统计学分析，计量资料用（x±s）表示，比较采用t检验；计数资料以率（%）表示，比较采用 字2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组SDS-PAGE蛋白条带比较 SDS-PAGE结果显示，所有样本的蛋白条带清晰，两组间蛋白条带重复性较好，并无明显蛋白丢失现象。

2.2 两组2-D DIGE结果比较 经2-D DIGE检测两组总蛋白整体分布相似，图像重复性较好、分辨率比较高，研究组与对照组平均蛋白质点数分别为（1596±207）个和（1603±164）个。

2.3 两组质谱分析鉴定结果 质谱分析结果显示，两组唾液蛋白存在五个差异明显的蛋白质，即分泌性IgA、锌α2糖蛋白、碳酸酐酶6、唾液淀粉酶和血清白蛋白，研究组中分泌性IgA表达下调，其余四种差异蛋白表达明显上调（P<0.01），见表1。

3 讨论

口腔扁平苔藓（OLP）在口腔疾病中比较常见，主要的临床表现为乳白色斑点，斑细小孤立，排列成环状、线状及不规则的网状，也有些患者出现斑块、萎缩、丘疹、侵蚀性溃疡和大疱[5]。目前其发病机制仍不明确，有自身免疫、感染、神经精神因素、细胞因子作用、家族遗传等学说，也有些人认为药物因素、内分泌异常、慢性病灶等因素也可诱发本病[6-7]。随着以蛋白质组学研究为主的后基因组时代的来临，人们开始从蛋白质组学的角度研究疾病的发生机制[8]。通过差异蛋白质来研究OLP，将更加全面地揭示其发生、发展过程中的重要蛋白质，为深入探讨OLP发生机制及临床诊治提供有效信息。

蛋白质组学技术迅速发展，2-D DIGE的出现有效地克服了传统2-DE技术的弊端，分辨率高，重复性好，减少实验误差带来的影响，使用荧光染料共价标记，可分析微量的蛋白质样品，灵敏度高[9-10]。唾液中既包含了血液中可以被常规检测到的所有蛋白、激素、抗体和其他分子标记，还包括许多唾液腺分泌的蛋白质等，可反映身体的健康状态[11]。OLP的发生会导致唾液中的蛋白质组分发生变化，因此准确全面地检测患者唾液的蛋白组分表达水平寻找出差异蛋白，对于进一步阐明OLP发病机制具有十分重要的意义。且唾液检查无创伤，简单方便，患者易于接受。本研究利用双向荧光差异凝胶电泳-质谱分析技术，成功筛选并鉴定出OLP患者唾液蛋白中存在分泌性IgA、锌α2糖蛋白、碳酸酐酶6、唾液淀粉酶和血清白蛋白五种差异蛋白质。

分泌性IgA在唾液中含量较高，与口腔的生理活动功能密切相关，许彦枝等[12]发现，OLP患者唾液蛋白中的分泌性IgA含量明显降低。本研究中研究组唾液蛋白中分泌性IgA含量明显低于对照组，与之前的相关报道保持一致，具有临床意义。这可能是由于当口腔腺体及其周围黏膜合成和分泌分泌性IgA不足时，唾液中分泌性IgA含量降低，病原体易侵入口腔引起感染[13]。锌α2糖蛋白作为一种脂解因子，可以促进脂肪细胞的脂质分解，在恶性肿瘤病人体内表达明显增高，特别是恶病质患者[14]。除了血清和精液，在尿液、唾液、汗液等体液中都能检测到这种蛋白[15]。本研究中锌α2糖蛋白在OLP患者唾液蛋白中表达上调，具体的机制有待进一步研究。

碳酸酐酶6具有维持口腔环境pH值平衡的功能[16]。研究发现唾液碳酸酐酶6减少时，龋齿发生率增加。本研究中OLP患者唾液蛋白中碳酸酐酶6增加，可能与口腔内细菌繁殖导致产酸增高有关。近年来，唾液淀粉酶活性检测的有效性逐渐得到认可，已经成为一种反映人体自主神经系统在压力及压力相关刺激下发生变化最为敏感的生物标记物[17]。在高度精神集中运算压力下，健康人群的唾液淀粉酶分泌会明显增加。焦虑患者唾液中的唾液淀粉酶活性与焦虑程度明显正相关[18]。长期的神经情绪紧张焦虑，很有可能诱发OLP，从而引起唾液淀粉酶含量的增加。唾液中的白蛋白主要来自血液，武影[19]等研究发现血清白蛋白在慢性牙周炎患者WUS中的表达上调。这主要是全唾液中含有10%来源的龈沟液成分，在牙周组织炎症状态下龈沟液流量增大，进入唾液的成分也可能增高[20]。本研究中研究组血清白蛋白表达上调，可能是由于OLP是一种慢性炎症性疾病，对局部黏膜产生的刺激影响唾液的分泌，诱发血清白蛋白含量增多所致。

综上所述，利用双向荧光差异凝胶电泳-质谱分析技术，筛选出OLP患者唾液蛋白存在的五种差异蛋白，但仍需要通过Western blot等技术进一步验证。本研究将继续探索本地区扁平苔藓患者唾液中蛋白质的代谢变化规律与发病机制，努力为临床诊疗提供依据。

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（收稿日期：2016-12-30） （本文编辑：周亚杰）