姜兴旭，陈发河

(集美大学食品与生物工程学院，福建 厦门 361021)



莲雾果实高质量总蛋白提取方法的建立

姜兴旭，陈发河

(集美大学食品与生物工程学院，福建 厦门 361021)

为了高质量提取莲雾果实总蛋白，选择TCA/丙酮法、匀浆法、酚抽提法、试剂盒法和裂解法，分别从莲雾果实中提取总蛋白，使用Bradford法测定蛋白含量，对蛋白含量较高的匀浆法、酚抽提法和试剂盒法进行SDS-PAGE电泳。结果显示，3种方法所得图谱都条带清晰且较无明显拖尾，其中酚抽提法所得图谱最完整清晰且蛋白得率最高，说明酚抽提法适合莲雾果实总蛋白提取。

莲雾；果实总蛋白；蛋白质提取；酚抽提法

莲雾(Syzygium samarangense (Blume)Merr.L.M.Perry)我国台湾17世纪就已引种，福建、广东、海南等南方多省也均有种植[1]。莲雾组织疏松、呼吸代谢旺盛，采收后未经处理，果肉短时间内急剧劣变甚至腐烂。为了研究采后莲雾果实贮藏期间蛋白质表达差异，探讨其絮状绵软的分子机理，提取其果实总蛋白及电泳是前提条件。莲雾果实中富含色素、果胶和多糖多酚类物质，能与蛋白质和核酸等生物大分子发生结合反应，导致总蛋白样品制备困难。目前蛋白质的提取方法很多，但在莲雾中却鲜有报道。

1 材料与方法

1.1 材料

采用台湾“黑珍珠”莲雾，购自厦门中埔台湾水果销售集散中心。挑选果实正常发育且形态相似，表面无外伤及病虫害侵染的新鲜莲雾果实。液氮速冻后，迅速置于-80 ℃冰箱备用。

1.2 莲雾果实总蛋白提取

以下步骤均在4 ℃条件下进行。

A.TCA/丙酮法: 迅速从超低温冰箱中取出保存的莲雾果肉组织5 g，含有1%交联聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)，液氮中研磨成粉末。加入4倍体积10% TCA(含0.07% β-巯基乙醇)匀浆液，-20 ℃沉淀3 h以上；20 000 g离心30 min，弃上清；沉淀物用冷丙酮(含20 mmol/L DTT)反复洗涤3次以上至丙酮无色。沉淀真空冷冻干燥，于-80 ℃低温保存备用。

B. 匀浆法: 称取5 g莲雾果肉(含1% PVPP)，液氮中研磨成粉末。加入5 mL配制好的匀浆缓冲液1 [20 mmol/L Tris-HCl(pH7.5)；250 mmol/L 蔗糖；10 mol/L EGTA；1 mmol/L PMSF；1 mmol/L DTT；1% Triton X-100]，继续研磨，混匀液20 000 g离心30 min，转移上清添加10%TCA，4 ℃放置2 h，20 000 g离心40 min，收集沉淀，冷丙酮冲洗3次以上至无色。沉淀物冻干，低温保存。

C. 酚抽提法: 称取5 g莲雾果肉(含1% PVPP)，液氮中研磨成粉末。加入5 mL配制好的匀浆缓冲液2(蔗糖浓度增于1.05 mol/L，其他物质浓度与1相同)后继续研磨，20 000 g离心30 min。上清液中加入等体积Tris饱和酚(pH7.8)，漩涡充分震荡，10 000 g离心30 min，回收上层酚相。再加入5倍体积的预冷甲醇(含0.1 mol/L 乙酸铵)，-20 ℃过夜放置以沉淀蛋白。冷甲醇、丙酮溶液中分别冲洗2次，收集沉淀物冻干保存。

D. 裂解法: 称取5 g莲雾果肉，加入1% PVPP，研磨成粉末，加入4倍体积匀浆液[0.5 mol/L Tris-HCl(pH7.5)；0.7 mol/L蔗糖；0.05 mol/L EDTA；0.1 mol/L KCl；1 mmol/L PMSF；2%(v/v)β-巯基乙醇；2%(w/v)SDS]继续研磨，再加入等体积Tris-饱和酚(pH7.8)研磨，20 000 g离心20 min，回收上层酚相。加入等体积匀浆液漩涡混匀，20 000 g离心20 min，回收酚相，该步骤重复3次。加入5倍体积预冷甲醇(含0.1 mol/L 乙酸铵)，-20 ℃过夜沉淀。冷甲醇、丙酮溶液中分别冲洗2次，收集沉淀物冻干保存。

E.试剂盒法采用贝博生物公司的Plant Protein Extraction Reagent试剂盒。

1.3 蛋白质样品溶解与定量

制备好的蛋白干粉溶于蛋白裂解液[7 mol/L尿素；2 mol/L硫脲；4%(w/v)CHAPS；2%(v/v)NP-40；1%(w/v)DTT；使用前加PMSF]中，充分裂解4～6 h，15 000 g离心30 min，取上清重复离心2次。上清液采用Bradford法测定蛋白浓度。

1.4 SDS-PAGE凝胶电泳

配置12%分离胶和5%浓缩胶，上样量为10 μL。浓缩胶内电泳设置为90 V，当溴酚蓝线到达分离胶时将电压提高至120 V。当溴酚蓝到达分离胶底部时停止电泳，进行考马斯亮蓝染色。

2 结果与分析

2.1 不同提取方法蛋白产量的分析

分别采用TCA/丙酮法、匀浆法、酚抽提法、试剂盒法和裂解法提取莲雾果实总蛋白，产量如表1所示。所得蛋白产量从高到低分别为酚抽提法、匀浆法、试剂盒法、裂解法和TCA/丙酮法。其中酚抽提法可达到1.63 mg/g鲜重，为TCA/丙酮法的2.43倍，具有显著差异(P<0.05)。匀浆法、试剂盒法和裂解法的提取量分别为酚抽提法的88.34%，79.14%和74.85%，酚抽提法从蛋白提取量上看效果最好。

表1 不同提取方法所获得的蛋白产量Tab.1 Protein yield of different extraction methods

注: 采用Bradford法测定蛋白浓度Y=0.0055X+0.0034，R2=0.9923。

2.2 不同提取方法SDS-PAGE带型对比

根据上一步实验结果，选择酚抽提法、匀浆法和试剂盒法提取所得的蛋白质溶解液，上样进行SDS-PAGE电泳，结果如图1所示。3种提取方法所获得的莲雾果实总蛋白在凝胶电泳中显示的条带数目较一致，均无明显拖带现象，但清晰度存在差异。其中酚抽提法所得样品条带最明亮，试剂盒法次之，匀浆法效果最差。电泳条带的明亮程度与蛋白浓度结果较一致。酚抽提法所得蛋白样品在低分子量处(20～35 Ku)也有明显分布，说明酚抽提法提取蛋白的分子量范围较广，最适合于莲雾果实总蛋白的提取，推测与莲雾果肉化学组成和蛋白特性有关。

A: 试剂盒法；B: 匀浆法；C: 酚抽提法；M: Marker图1 不同提取方法所得莲雾果实总蛋白的SDS-PAGE图谱比较Fig.1 Comparison of SDS-PAGE patterns of total protein samples obtained by different extraction methods

3 讨论

蛋白质样品提取是蛋白组学研究的前提。本实验尝试应用TCA/丙酮法、匀浆法、酚抽提法、试剂盒法和裂解法5种方法。提取中发现，液氮研磨的成功可以有效保证蛋白质样品的质量。本实验在液氮研磨过程中均添加了1% PVPP。已有文献报道，PVPP是强氢离子受体，可高效吸附多酚类物质，去除杂质污染[2]。莲雾果实中色素较多，而TCA/丙酮法在提取过程中能较好去除色素，但其蛋白得率最低。TCA为强酸，容易造成蛋白质解体断裂。提取过程中多次溶解的过程可能增加蛋白质再溶的困难性，从而导致总蛋白大量流失[3]。酚抽提法中，酚是蛋白质的良好溶剂，蛋白质和脂类溶于酚相，而多糖、多酚等可溶性杂质溶于水相，达到初步分离后，酚相中的蛋白质可通过含乙酸铵的甲醇溶液进一步纯化。

[1] 李春福.东山县莲雾的生产技术[J].中国农业信息，2016，(03):112-113.

[2] Laborde B，Moineledoux V，Richard T，et al. PVPP-polyphenol complexes: a molecular approach[J].Journal of Agricultural & Food Chemistry，2006，54(12):4383.

[3] 郭立安，阎哲，张晓楠，等.三氯乙酸对蛋白质结构稳定性的影响[J].医学争鸣，2001，22(22):102.

Establishment of high quality total protein extraction method for syzygium samarangense

JIANG Xing-xu，CHEN Fa-he

(College of Food and Bioengineering, Jimei University, Xiamen 361021, China)

In order to establish the method of high quality extraction of total protein of syzygium samarangense, the total protein was extracted from the fruit of rhamnus officinalis by TCA/acetone method, homogenization method, phenol extraction method, kit method and lysis method respectively. Protein content was determined by Bradford method, SDS-PAGE was performed on homogenization, phenol extraction and reagent method. The results showed that the patterns of the three methods were clear and had no obvious tailing, and the deduced extraction pattern was the most complete and the highest protein yield.

Syzygium samarangense; Fruit total protein; Protein extraction; Phenol extraction method

2017-02-17

姜兴旭(1992-)，女，硕士研究生。

陈发河(1960-)，男，硕士，教授。

TS205

A

1674-8646(2017)08-0084-02