郭琲婷 郭晓霞

山西省中医药研究院2014级硕士研究生班 （山西 太原，030012）

基于TLR4／NF-κB信号通路研究调肝理脾方联合熊去氧胆酸干预原发性胆汁性胆管炎小鼠的作用机制*

郭琲婷 郭晓霞△

山西省中医药研究院2014级硕士研究生班 （山西 太原，030012）

目的：通过研究肿瘤坏死因子-a（TNF-α）及Toll样受体4／核转录因子κB（TLR4／NF-κB）信号通路相关基因在原发性胆汁性胆管炎（PBC）模型小鼠回肠组织中的表达情况，探讨中药调肝理脾方（TGLP）联合熊去氧胆酸（UDCA）干预PBC小鼠的作用机制。方法：将100只C57BL／6雌性小鼠随机分为正常组、模型组、阳性组（UDCA 0.1g·kg－1·d－1）、中药组（TGLP 5.4g·kg－1· d－1）、联合组（TGLP 5.4g·kg－1·d－1＋UDCA 0.1g·kg－1·d－1），每组20只；采用聚肌胞苷酸（poly l：C）5mg／kg复制PBC小鼠模型；给药8w、16w后颈脱位法处死小鼠，采集末端回肠，采用酶联免疫吸附试验（ELISA）法及实时荧光定量PCR（RT-PCR）法检测回肠组织中TLR4、TNF-α的表达水平，RT-PCR法测定回肠组织中TLR4、NF-κBmRNA的相对表达水平。结果：与模型组比较，正常组小鼠回肠组织中NF-κB、TNF-α表达水平较低，差异有显著性意义（P＜0.01）；经治疗后3个治疗组小鼠TLR4、NF-κB、TNF-α表达水平均较模型组降低，差异有显著性意义（P＜0.01或P＜0.05），且联合组小鼠TLR4、NF-κB、TNF-α表达水平下降最显著；与联合组相比，中药组小鼠NF-κB表达水平较高，差异有显著性意义（P＜0.01或P＜0.05）。结论：负性调节小鼠回肠组织中TLR4／NF-κB信号通路并抑制TNF-α因子的释放可能是TGLP联合UDCA干预PBC模型小鼠的作用机制之一。

原发性胆汁性胆管炎；调肝理脾方；TLR4／NF-κB信号通路；TNF-α

原发性胆汁性胆管炎（PBC）是一种病因未明的以慢性进行性、非化脓性、肝内小胆管破坏、胆汁淤积性为特征的自身免疫性疾病，好发于中年女性，可逐渐发展到肝纤维化、肝硬化，最终导致肝衰竭而需肝脏移植［1］。近年来国内外基础与临床研究表明，多种肝病的发生、发展与肠道微生态的变化关系密切，有学者指出［2，3］，PBC患者中肠道微生物可能通过肿瘤坏死因子-a（TNF-α）发挥致病或免疫调节的作用，而TNF-α的产生与Toll样受体4／核转录因子κB（TLR4／NF-κB）信号通路密切相关。调肝理脾方是郭晓霞导师在长期临床工作中拟定的经验方，经过临床反复验证，该方可明显改善PBC患者的肝纤维化程度及生存质量。前期动物实验研究证明，调肝理脾方对PBC小鼠慢性肝损伤及小胆管改变具有很好的防护作用［4］，我们选用调肝理脾方联合熊去氧胆酸，观察其对PBC模型小鼠回肠组织中TNF-α及TLR4、NF-κB表达水平的影响，探讨调肝理脾方联合熊去氧胆酸干预PBC的作用机制。现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 实验动物选用5-6周雌性SPF级C57BL／6小鼠100只，体质量18±2g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，许可证号：SCXK（京）2014-0004。

1.2 药物 熊去氧胆酸胶囊（公司：Dr.Falk Pharma GmbH，生产企业：Losan Pharma GmbH，产品批号：12K21424L），规格250mg／粒，25粒／盒。实验室用双蒸水配制成浓度为0.5%的混悬液。调肝理脾方由以下药物组成：炙黄芪、丹参、枸杞子各30g，山药20g，白术、茯苓各15g，柴胡、姜黄、羌活、忍冬藤各10g，陈皮6g，郁金12g，均由江阴天江药业有限公司提供的免煎颗粒。根据前期研究，选用疗效最佳的中剂量，在实验室用双蒸水配制成浓度为66.7%的免煎溶液。

1.3 主要试剂及仪器 聚肌胞苷酸Poly C（美国Amersco公司），小鼠TNF-αELISA试剂盒（上海酶联生物科技有限公司）；PCR引物（上海生工生物工程有限公司），EasyPure®RNA Kit（北京全式金生物技术有限公司，ER101），TransScript®First-Strand cDNA Synthesis SuperMix（北京全式金生物技术有限公司，AT301），QuantiFast®SYBR®Green PCR Kit（德国QIAGEN公司）。组织匀浆机（德国IKA公司，T25 ULTRA-TURRAX），微孔板检测仪（美国BioTek公司，Synergy H1）；低温台式离心机（美国Beckman Coulter公司，Auegrax-30k），Veriti定性PCR仪（美国Applied Biosystems公司，9902），荧光定量PCR仪（美国Applied Biosystems公司，7500）。

1.4 动物分组及处理 实验动物自由进食饮水，适应性饲养1w后，称取体重。采用Excel随机分组方法［5］，根据体重随机分组设计，生成随机数字，将100只C57BL／6小鼠随机分配到5个实验组中，每组20只，分别是正常组、模型组、阳性组（UDCA 0.1g·kg－1·d－1）、中药组（TGLP 5.4g·kg－1·d－1）、联合组（TGLP 5.4g·kg－1·d－1＋UDCA 0.1g·kg－1·d－1）。参考文献报道［6～8］，除正常组外，其余4组小鼠均腹腔注射聚肌胞苷酸（poly l：C）5mg／kg，正常组小鼠予等体积生理盐水腹腔注射，2次／w，连续16周。8周、16周时颈脱位法处死小鼠（处理前禁食一天），每个时间点10只，采集末端回肠，0.9%生理盐水冲洗后保存于-80℃冰箱以备检测。

1.5 检测指标及方法

1.5.1 肠组织中TNF-α的检测 使用ELISA检测试剂盒检测肠组织中TNF-α浓度。步骤参照试剂盒说明。实时荧光定量PCR（qRT-PCR）法测定肠组织中TNF-αmRNA的表达水平。步骤参照试剂盒说明。引物序列见表1。

1.5.2 肠组织中TLR4、NF-κB的检测 采用RT-PCR法检测肠组织中TLR4mRNA、NF-κBmRNA表达水平。步骤参照试剂盒说明。引物序列见表1。

表1 引物序列

1.6 统计学方法 所有数据采用SPSS 21.0统计软件进行统计学处理，数据以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠一般情况 实验过程中，正常组死亡1只，模型组死亡1只，阳性组死亡2只，联合组死亡3只中药组死亡0只，共死亡7只老鼠，均因灌胃后出现死亡，解剖后未发现器质性病变，考虑可能与灌胃时操作不当有关。

2.2 各组小鼠肠组织中TNF-α的表达水平 见表2。

表2 各组小鼠肠组织中TNF-α表达水平比较 （±s）

表2 各组小鼠肠组织中TNF-α表达水平比较 （±s）

与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

正常组8 153.00±21.35**153.81±10.31**模型组8 230.61±40.39 236.86±43.55阳性组8 189.31±17.33**180.33±28.06**中药组8 194.95±31.40*198.32±36.64*联合组8 179.73±24.17**176.17±24.03**

2.3 各组小鼠肠组织中TLR4、NF-κB、TNF-αmRNA的表达水平（2△△CT值）（见图1到图4） 各实验组内参基因β-actin和TLR4、NF-κB、TNF-α熔解曲线中均有单一的主峰，熔解温度为85℃，相同扩增条件下重复多次，得到的β-actin和TLR4、NF-κB、TNF-α熔解温度均在85℃左右，变化不超过1℃，说明所扩增的产物具有特异性。

图1 β-actin内参基因溶解曲线

图2 TLR4基因溶解曲线

图3 NF-κB基因溶解曲线

图4 TNF-α基因溶解曲线

根据实时荧光定量PCR检测结果及2△△CT值显示，与模型组比较，正常组小鼠肠组织中TLR4、NF-κB、TNF-α基因表达水平较低，差异有统计学意义（P＜0.01）；各治疗组小鼠肠组织中TLR4、NF-κB、TNF-α基因表达水平有不同程度的下降但均高于正常组，其中联合组下降明显，差异有统计学意义（P＜0.01或P＜0.05）。与联合组比较，中药组TLR4、TNF-α基因表达水平较高，差异无统计学意义（P＞0.05）；NF-κB基因表达水平较组高，差异有统计学意义（P＜0.01或P＜0.05）。与联合组比较，阳性组TLR4、NF-κB、TNF-α基因表达水平均有升高，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

表3 各组小鼠肠组织中TLR4、NF-κB、TNF-αmRNA表达水平2△△CT的比较 （±s）

表3 各组小鼠肠组织中TLR4、NF-κB、TNF-αmRNA表达水平2△△CT的比较 （±s）

与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与联合组比较，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01

组别n 8周TLR4 NF-κB TNF-α 16周TLR4 NF-κB TNF-α正常组8 0.24± 0.92**0.18± 0.05**0.30± 0.15**0.22± 0.82**0.26± 0.14**0.29± 0.14**模型组8 1.07± 0.17 1.00± 0.13 1.04± 0.10 1.06± 0.22 1.01± 0.13 1.03± 0.07阳性组8 0.53± 0.21**0.51± 0.13**0.66± 0.12**0.49± 0.12**0.51± 0.16**0.65± 0.21**中药组8 0.67± 0.26*0.59± 0.15**＃＃0.70± 0.24**0.62± 0.17**0.58± 0.12**＃0.70± 0.16**阳性＋中药组8 0.47± 0.20**0.34± 0.10**0.49± 0.12*0.45± 0.07*0.35± 0.12**0.49± 0.14**

3 讨论

PBC是一种病因未明的自身免疫性、慢性进行性肝脏疾病，其病理特点以肝内细小胆管的非化脓性破坏、汇管区炎症、胆汁淤积、肝纤维化为主，可发展为肝硬化，最终导致肝衰竭而需肝脏移植。PBC多见于中老年女性［10］，最常见的临床表现为乏力和皮肤瘙痒。全球范围内PBC的年发病率为0.33～5.8／10万，患病率为1.91～40.2／10万［11］；我国的发病率虽无大样本流行病学调查结果，但近年来PBC的发病率及检出率逐渐增多，2010年在对广州当地人的调查中显示，PBC的患病率为49.2／10万，其中40岁以上女性的患病率为155.8／10万。血清抗线粒体抗体（AMA）阳性，特别是AMA-M2亚型阳性对本病诊断具有很高的敏感性和特异性。

中医学没有PBC病名，根据疾病阶段及临床表现将其归属于“胁痛”、“积聚”、“黄疸”、“鼓胀”等病症。历代医家对病因病机的认识各不相同，张景岳将胁痛的病因分为外感和内伤。肝为将军之官，性喜条达，调畅气机，情志不遂、饮食不节、外感湿热、病后所致等均可受累于肝，发为本病。结合文献查阅［12，13］及前期研究［14］发现，肝郁脾虚是PBC患者的基本证型，研究中采用腹腔注射聚肌胞苷酸C57BL／6小鼠，成功建立了早期PBC小鼠动物模型，经郭晓霞导师经验方调肝理脾方干预后，通过肝组织病理及超微结构观察肝损伤情况，结果提示调肝理脾方可有效抑制胆小管的增生及胶原纤维的沉积。调肝理脾方以柴芍六君子汤为基础方，佐以枸杞子、黄芪、丹参补肾以固本，忍冬藤、羌活祛风胜湿，共奏调肝健脾、补肾祛湿之效。熊去氧胆酸（UDCA）是经随机对照试验研究证实的安全有效的治疗药物［15］，虽能够改善生物化学和临床指标，但并不能真正改善患者的远期生存率和对肝移植的需求，对UDCA生化应答欠佳的患者，目前尚无统一的治疗方案。前期研究表明［15］，调肝理脾方联合UDCA治疗PBC较单用中药或西药的效果更好。本研究沿用上述方法成功建立PBC动物模型，对调肝理脾方联合熊去氧胆酸改善PBC模型小鼠的作用机制进行了探讨。

Toll样受体（TLRs）是介导天然免疫及病原体信号转导与细胞活化信号转导的重要跨膜信号传递受体，可识别高度保守的微生物组分—病原相关分子模式（PAMPS），在B淋巴细胞、NK细胞、单核-巨噬细胞及树突状细胞表面都有分布，主要在天然免疫系统的细胞上表达。迄今为止，已经发现至少15种TLRs。由TLRs介导的信号转导通路可以诱导很多反应的快速活化，产生一氧化氮合成酶、抗菌肽、炎症细胞因子、共刺激分子、趋化细胞因子等效应分子，激活炎症反应，参与机体防御反应［16］。目前研究以TLR4／NF-κB信号传导途径较多且最为明确，在Yoon等［17］用LPS刺激BV2细胞所造成的炎症模型中，TLR4和NF-κB蛋白表达相对于对照组均有所增高。TLR4介导的MyD88依赖性途径作为经典传导途径，其主要激活NF-κB并促使细胞因子的产生［18］。NF-κB是真核细胞中普遍存在的一类具有多向性调节作用的诱导性核转录因子，这些基因编码促炎细胞因子和内在免疫和急性时相反应蛋白［19，20］，广泛调控着免疫反应、应激反应和炎症反应相关的基因表达。

在多种肝脏疾病，如病毒性肝炎、酒精性肝病、肝硬化和肝癌患者中大部分存在肠道菌群的移位和肠源性内毒素血症［21］，动物实验也证实肠源性内毒素在肝纤维化［22］和酒精性肝病［23］的发生发展中起重要作用。因此，PBC也存在由各种因素通过多途径、多环节、多机制造成肠粘膜损伤，引起一系列的并发症。引起损伤的各种因素中，促炎细胞因子起了重要作用，TNF-α是公认的促炎细胞因子，其产生与TLR4／NF-κB信号通路密切相关。炎症反应中，促炎因子如TNF-α，IL-1β，IL-6和IL-8对NF-κB转录家族的激活将诱导其基因转录，从而产生更多的细胞因子［24］，加重肠粘膜损伤。

本次研究基于TLR4／NF-κB信号通路，采用ELISA法及实时荧光定量PCR技术对PBC小鼠末端回肠中促炎细胞因子TNF-α进行了检测，结果显示TGLP联合UDCA可降低TNF-α的表达水平，同时，我们采用实时荧光定量PCR技术检测PBC模型小鼠末端回肠中TLR4mRNA、NF-κBmRNA，结果显示TGLP联合UDCA亦可同时降低TLR4、NF-κB的表达水平。研究结果提示，TGLP联合UDCA干预PBC模型小鼠时，可通过负性调节TLR4／NF-κB信号通路，进而抑制TNF-α细胞因子的释放，减轻肠粘膜的损伤。这对于探讨中药联合UDCA以减轻肠粘膜损伤，改善肝脏损伤来干预PBC的作用机制及作用靶点有重要意义，未来有望通过多中心、大样本统计的研究方式，为治疗PBC提供新的临床思路。

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Investigation on themechanism of TLR4／NF-κB signaling pathway in the treatment of primary biliary cholangitis in m ice w ith Tiaogan Lipi decoction and Ursodeoxycholic acid

GUO Bei-ting，GUO Xiao-xia.Shanxi research institute of traditional Chinesemedicine（Taiyuan Shanxi，030012）China

Objective：TO study the hemechanism of TLR4／NF-κB signaling pathway in the treatment of primary biliary cholangitis in mice with Tiaogan Lipi decoction and Ursodeoxycholic acid.Methods：100 C57BL／6 femalemice were randomly divided into normal group，model group，positive group（UDCA 0.1g·kg－1·d－1），Chinesemedicine group（TGLP5.4g·kg－1·d－1）and drug combination group（TGLP 5.4g·kg－1·d－1＋UDCA 0.1g·kg－1·d－1），20 in each group.Establish PBC animalmodel by injectingwith cytidine polyinosinic acid（poly l：C）5mg／kg to them.Allmicewere executed through cervical dislocationmethod after8 and 16 weeks and fasted for24h before processing.Terminal ilea were taken outand cleaned in 0.9%saline，and then stored in－80℃refrigerator for detection.With themethod of enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）and real-time fluorescent quantitative PCR（qRT-PCR）.The level of TNF-α，TLR4 and NF-κBmRNA were detected through ELISA and PCR，respectively.Results：Compared with themodel group，the expression levels of NF-κB and TNF-αin the normal group ilea were lower，a statistically significant difference（P＜0.01）.By comparison，the expression level of TLR4 in the normal group was lower than that in themodel group，withouta statistically significant difference（P＞0.05）.The expression levels of TLR4，NF-κB and TNF-αin the treatment groupswere lower than that in themodel group，a statistically significant difference（P＜0.01 orP＜0.05），decreasing significantly in the drug combination group.Compared with the drug combination group，the expression level of NF-κB in the Chinesemedicine group was higher，a statistically significant difference（P＜0.01 orP＜0.05）.Conclusion：Negatively regulating TLR4／NF-κB signal pathway and reducing the release of TNF-αin the ileum tissuemay be one of the actionmechanism in the treatmentof primary biliary cholangitis in mice with Tiaogan Lipi decoction and Ursodeoxycholic acid.

primary biliary cholangitis；Tiaogan Lipi decoction；TLR4／NF-κB signal pathway；TNF-α

10.3969／j.issn.1005－0264.2017.02.013

2016－08－30 编辑：肖明中）

山西省自然科学基金面上项目（No.2015011102）；△通讯作者，E-mail，245467575＠qq.com