秦雪琴徐 航吴文琴雷尚芳陈 悦

1.湖北省十堰市太和医院（湖北医药学院附属医院）感染科 （湖北 十堰，442000） 2.十堰市太和医院急诊科

丹参酮胶囊对大鼠同种异体肝移植后缺血再灌注肝损伤的防护作用*

秦雪琴1徐 航1吴文琴2△雷尚芳1陈 悦1

1.湖北省十堰市太和医院（湖北医药学院附属医院）感染科 （湖北 十堰，442000） 2.十堰市太和医院急诊科

目的：研究丹参酮胶囊对大鼠同种异体肝脏移植后P450亚型酶及肝功能的影响，分析术后缺血再灌注肝损伤的防护机制。方法：SD大鼠64只，随机分为对照组、模型组、丹参酮胶囊小、大剂量组，除对照组外其余3组大鼠均采用改良双袖套法建立大鼠同种异体肝移植模型，丹参酮胶囊小、大剂量组大鼠分别用1%和2%丹参酮胶囊溶液灌胃3W，对照组及模型组大鼠灌等体积生理盐水。3W后取静脉血检测大鼠肝功能五项、血清总超氧化物歧化酶（T-SOD）、白细胞介素-6（IL-6）、前列腺素E2（PGE2）水平；取大鼠肝脏检测肝微粒体P450亚型酶活性。结果：丹参酮胶囊小、大剂量组大鼠T-SOD明显提高、CYP2E1、CYP2C9酶活性、IL-6、PGE2及r-GT、TBA、TBil明显下降，存活率分别达56.25%及62.5%，与模型组比较，P＜0.05，差异有统计学意义。结论：丹参酮胶囊可提高同种异体大鼠肝脏移植术后T-SOD活性，促进氧自由基清除酶清除氧自由基、降低炎症因子IL-6、PGE2刺激机体造成的炎症反应，并通过抑制P450亚型酶活性来减轻药物代谢时对肝脏的毒性，其活血化瘀的药理特性可增加移植肝脏组织供氧，促进肝功能恢复，提高肝脏移植存活率。

丹参酮胶囊；同种异体肝移植；P450亚型酶；肝功能；防护作用

我们用丹参酮胶囊配制成1%和4%的溶液灌胃，观察其对同种异体大鼠肝脏移植术后P450亚型酶及肝功能的影响，分析术后药物干预缺血再灌注肝损伤的防护机制，为临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物及分组 SD大鼠64只，6～8周龄，雄性，体重180～200g，由中国医学科学院实验动物中心提供，合格证编号为SCXK（京）2005-0013。按随机原则分为对照组、模型组、丹参酮胶囊小、大剂量组，每组16只。

1.2 仪器及药品 Thmorgan LC2000R型高速冷冻离心机（北京托摩根生物科技有限公司阁）；岛津Shimadzu LC-15C型高效液相色谱仪（苏州岛津，产品）；SHZ-82A水浴恒温振荡器（常州国华振荡器生产）；丹参酮胶囊（河北兴隆希力药业有限公司生产，规格：0.25g／粒，批号：30Z00211）。

1.3 大鼠同种异体肝移植术及治疗方法 采用改良双袖套法，手术时采用“2回折、3结扎、4贯通”的方法制备同种异体肝移植动物模型［1］。造模前分别取各组受体和供体8只大鼠同时手术（每组合计16只），目的是节约动物，这符合减少实验动物的伦理要求［2］。术前供、受体大鼠均自由饮水，禁食，配对大鼠体质量应相差≤20g。于术前20min肌肉注射阿托品0.04mg，3%戊巴比妥钠0.1ml／100g腹腔注射麻醉，剃去腹部毛发，碘伏消毒，腹部向上仰卧位固定于大鼠固定器，打开腹腔（供体、受体手术应同时进行），将受、供体大鼠肝脏各取1／2进行交叉植入配对动物，吻合植入肝脏血管，分层缝合腹腔，碘伏消毒创口1w（1次／d），对照组大鼠不手术仅作为空白对照。术后参照人与动物体表面积换算公式［3］，将丹参酮胶囊配制成1%和4%的溶液备用，大鼠用药剂量（mg／kg）＝w（人与兔体表面积换算系数）×A（人用药剂量）。经以上公式计算，丹参酮胶囊小、大剂量组大鼠分别用1%和2%丹参酮胶囊溶液1m l· kg－1·d－1（即2.5mg·kg－1·d－1、5mg·kg－1·d－1）灌胃；对照组及模型组大鼠灌等体积生理盐水，均灌胃3w。

1.4 检测指标 参照文献［4］，眶静脉取大鼠静脉血0.5mL，编号检测肝功能［包括：血清总胆汁酸（TBA）、r-谷氨酰软肽酶（r-GT）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、血清总胆红素（TBil）等5项］。实验室检测静脉血T-SOD、IL-6、PGE2水平。取血后断头处死大鼠，并给肝组织编号置于-4℃冰箱，制备大鼠肝微粒体时用高速冷冻离心机，差速离心法制备肝微粒体混合液。方法：用500μL加样器取匀浆缓冲液加入肝微粒体混合液中，4℃下5000转离心30min，匀浆30min后将离心管中沉淀组织重悬于0.25 mol·L的蔗糖溶液中，用500μL加样器吸取100μL上述匀浆混合液（肝微粒体），-80℃冰箱暂存以备检测大鼠细胞色素P450亚型酶。检测将上述肝微粒体匀浆混合液用SHZ-82A水浴恒温振荡器37℃先孵育30min，然后再振荡30min，再用型高速冷冻离心机离心20min，取试管中上清液，用高效液相色谱仪进样，检测4组大鼠细胞色素P450亚型酶（包括CYP2E1、CYPIA2、CYP3A4、CYP2D6、CYP2C9）的活性。

1.5 统计学方法 采用SPSS19.0统计软件进行数据分析，肝功能、血清T-SOD、IL-6、PGE2及细胞色素P450亚型酶等实验数据以±s表示，组间比较采用方差分析及t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠肝功能检测情况 见表1。

表1 各组大鼠肝功能检测结果比较 （±s）

表1 各组大鼠肝功能检测结果比较 （±s）

与对照组比较△P＜0.05；与模型组比较▲＜0.05

对照组16 10.30± 0.50）31.58± 4.57 91.37± 8.57 137.39± 10.56 34.57± 3.32模型组4 29.23± 2.05△90.07± 8.97△254.23± 24.20△404.32± 32.92△97.87± 10.61△丹参酮胶囊小剂量组9 19.78± 1.10▲49.74± 3.13▲132.74± 13.15▲245.72± 21.11▲65.01± 7.44▲丹参酮胶囊大剂量组10 18.92± 1.37▲42.32± 3.62▲129.32± 12.31▲219.21± 18.72▲64.79± 7.38▲

2.2 各组大鼠血清T-SOD、IL-6、PGE2检测结果 见表2。

表2 各组大鼠血清T-SOD、IL-6、PGE2结果比较 （±s）

表2 各组大鼠血清T-SOD、IL-6、PGE2结果比较 （±s）

与对照组比较，△P＜0.05；与模型组比较，▲P＜0.05

组别n T-SOD（μmol／L）PGE2（U／L）IL-6（U／L）对照组16 111.37±10.53 5.58±0.27 9.37±0.53模型组4 34.23±2.20△27.07±2.90△154.23±14.25△丹参酮胶囊小剂量组9 59.74±4.11▲19.72±3.78▲102.74±10.11▲丹参酮胶囊大剂量组10 62.32±5.39▲17.329±3.61▲97.32±10.39▲

2.3 各组大鼠细胞色素P450亚型酶活性检测情况 见表3。

表3 各组大鼠细胞色素P450亚型酶活性比较 （±s，nmoL／mL）

表3 各组大鼠细胞色素P450亚型酶活性比较 （±s，nmoL／mL）

与对照组比较，△P＜0.05；与模型组比较，▲P＜0.05

组别n CYPIA2 CYP2E1 CYP2C9 CYP3A4 CYP2D6对照组16 1.79± 0.27 1.59± 0.21 4.49± 0.15 2.58± 0.21 2.12± 0.25模型组4 5.34± 0.59△3.95± 0.27△7.17± 0.43△9.90± 0.47△4.58± 0.37丹参酮胶囊小剂量组9 4.87± 0.31 2.49± 0.21▲5.41± 0.41▲8.98± 0.51 4.07± 0.28丹参酮胶囊大剂量组10 4.73± 0.43 2.12± 0.23▲5.09± 0.67▲9.12± 0.54 4.18± 0.29

2.4 各组大鼠存活及一般情况 见表4。对照组大鼠反应敏捷，体毛光泽，饮食正常，无动物死亡。模型组大鼠存活4只，存活率25%，存活大鼠卷缩，拒绝活动，体重明显降低，精神极差，无添足添毛等自洁行为，偶有摄食、少量饮水。丹参酮胶囊小、大剂量组分别有9、10只大鼠存活，存活率56.25%和62.5%，存活率明显高于模型组。存活大鼠动物自洁行为、摄食、饮水及体重明显优于模型组。

表4 各组大鼠存活及体质量比较（±s）

表4 各组大鼠存活及体质量比较（±s）

与对照组比较，△P＜0.05；与模型组比较，▲P＜0.05

组别存活例数（只）存活率（%）体质量（g ）对照组16 100 207.49±17.15模型组4 25△125.38±10.27△丹参酮胶囊小剂量组9 56.25▲149.42±9.21▲丹参酮胶囊大剂量组10 62.25▲145.12±10.23▲

3 讨论

血清T-SOD可促进氧自由基的清除，清除氧自由基、降低炎症因子IL-6、PGE2刺激机体造成的炎症反应。PGE2是一种重要的细胞生长和调节因子，是花生四烯酸环氧合酶代谢产物，PGE2过多分泌是造成炎症反应的重要因素。细胞色素P450亚型酶包括CYPIA2、CYP2E1、CYP3A4、CYP2C9、CYP2D6等多种亚型，是药代谢的主要水解酶，药物吸收后90%均经过细胞色素P450亚型酶代谢分解，P450活性增强常导致药物代谢加快、药物活性降低或失效而影响治疗作用［5］。任何抑制与诱导细胞色素P450亚型酶活性的药物均会影响药物疗效。肝功能五项可客观反应肝功能，因此，我们采用P450亚型酶、PGE2、T-SOD及肝功能五项等指标评定丹参酮胶囊对大鼠同种异体肝脏移植的影响。

由于CYP2C9和CYP2E1酶与药物代谢及相互作用密切相关［6］，CYP2C9和CYP2E1酶降低有利于药物的代谢，减少不良反应、增加疗效，对缺血再灌注肝脏具有防护作用［7，8］。本实验中，丹参酮胶囊通过抑制CYP2C9和CYP2E1酶活性，降低代谢产物毒性，增加疗效。机体在代谢正常的状态时，氧自由基生成与清除保持在动态平衡，当组织由于缺血，再灌注时，T-SOD活性急剧下降，大量氧自由基产生，这些氧自由基会发生严重的脂质过氧化反应。在本实验中，肝脏移植后随着血管吻合后血液再通会造成严重的缺血＼再灌注损伤，多项观察指标异常升高，这在模型组中得以证实。而丹参酮胶囊小、大剂量组大鼠在治疗3W后T-SOD酶的活性明显提高，IL-6和PGE2炎症因子的释放明显降低，提示丹参酮胶囊确有肝脏术后缺血＼再灌注损伤防护作用，这与大多数学者研究结果一致［9，10］。TSOD酶活性提高的作用机制有可能与降低细胞内H-ATP酶水解活性、同时增加H-ATP酶合成，阻止黄嘌呤脱氢酶向黄嘌呤氧化酶的转变，调节细胞内能量代谢，减少自由基的产生有关［11］。腺苷蛋氨酸由机体ATP和蛋氨酸腺苷蛋氨酸环化酶的作用下生成，当机体在缺血或其他病理改变时，腺苷蛋氨酸转甲基功能受限，质膜磷脂甲基化降低，肝脏细胞膜流动性和Na-K＋-ATP酶的泵功能均会下降，这会造成肝功能5项指标均升高，肝脏解毒功能降低或丧失［12，13］。结果还说明丹参酮胶囊具有促进肝功能恢复的作用，这可能丹参酮具有增加组织分泌腺苷蛋氨酸，增强Na-K＋-ATP酶泵功能，调节Na-H的交换，促进质膜磷脂甲基化，抑制肝细胞Na-Ca2＋钙交换，阻止肝组织间液Ca2＋内流造成的钙超载，改善肝细胞能量代谢有关［14］。同时，丹参酮还可肝脏的微循环，增加缺血肝脏供氧，减轻IL-6和PGE2炎症因子对血管壁炎症刺激，而对缺血＼再灌注损伤而起到防护作用。

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The protective effect of Salvia m iltiorrhiza Capsule on ischem ia reperfusion injury after liver transplantation in rats

QIN Xue-qin1，XU Hang1，WUWen-qin2，etal.1.Departmentof infectious disease，Shiyan Taihe Hospital（Affiliated Hospitalof HubeiMedical College）（Shiyan Hubei，442000）China.

Objective：To study the effects of Salviamiltiorrhiza Capsule on ischemia reperfusion injury after liver transplantation in rats and to analyze its protectivemechanism.Methods：64 male SD rats were randomly divided into control group，model group，tanshinone capsule low and high dose group，except the control group were treated with modified double cuffmethod to establish rat orthotopic liver transplantation model，tanshinone capsule low and high dose group were used 1%and 2%of tanshinone capsule solution by gavage for 3 weeks（W），control group and model group were given equal volume of saline.After 3 W，liver function，serum total superoxide dismutase（TSOD），interleukin-6（IL-6），prostaglandin E2（PGE2）level and livermicrosomal P450 subunit activity were detected in the rat liver.Results：compared with themodel group，The T-SOD in tanshinone capsule low，high dose group increased significantly；CYP2E1，CYP2C9 enzyme activity，IL-6，PGE2，GGT，total bile acid（TBA），STB decreased significantly，the survival rate were 56.25%and 62.5%，respectively，the difference was statistically significant（P＜0.05）.Conclusion：Tanshinone capsule could increase the T-SOD activity after allograft orthotopic liver transplantation in rats，promote oxygen free radical scavenging enzyme oxygen free radical removal，reduce inflammatory cytokines IL-6 and PGE2 stimulated body.

Salviamiltiorrhiza Capsule；liver transplantation；P450 subtype；liver function；protective

10.3969／j.issn.1005－0264.2017.02.012

湖北省卫生和计划生育委员会西医类重点项目（No.WJ2015MB224）；△通信作者，E-mail：fenyanqin163163＠126.com

2016－11－19 编辑：肖明中）