阎晶璐 薛晓兴 李君玲 夏 恺 王 田 王 伟

北京中医药大学研究院 （北京，100029）

肝纤维化大鼠肝气郁结证与肝藏血关系的研究*

阎晶璐 薛晓兴 李君玲 夏 恺 王 田 王 伟△

北京中医药大学研究院 （北京，100029）

目的：探讨中医藏象理论“肝藏血主疏泄”相关肝脏病理生理学基础。方法：以四氯化碳皮下注射法建立肝纤维化肝气郁结证大鼠模型，利用血生化检测法及高效液相色谱检测法，研究其血清及脑部主要蛋白标志物的含量变化。结果：在肝纤维化病程之中大鼠的肝纤维化标志物ALT、AST、IV-C、LV、HA、TGF-b，脑血管轴标志物ANG-II、NE，脑肠轴标志物5-HT、CRH-ACTHCORT等均有升高，神经内分泌轴标志物等多种蛋白含量均有发生变化。结论：血清及脑部主要蛋白标志物含量变化与肝藏血主疏泄理论具有相关性。

肝纤维化大鼠；肝气郁结证；肝藏血；血清蛋白标志物

“肝藏血”是现代藏象理论中关于肝功能重要的描述，其主要的生理病理生物学基础尚不明确。前期研究发现，四氯化碳造模的肝纤维化大鼠在4～10W多表现为肝气郁结证。本实验通过分析研究肝纤维化疾病模型大鼠的血清蛋白主要标志的含量变化，探索肝纤维化肝气郁结证病程中肝藏血主疏泄的生物学基础。

1.材料与方法

1.1 实验动物 实验动物60只SD大鼠，雄性，体重140～160g，SPF级，购自北京维通利华实验动物技术有限公司（实验动物生产许可证：SCXK（京）2006－0009），所有动物均饲养于北京中医药大学科研实验中心实验室。所有大鼠先适应性饲养1W，自由饮食。

1.2 药品与试剂 四氯化碳（国药集团有限公司）；花生油（鲁花花生油，山东鲁花集团产品）；水合氯醛（国药集团有限公司）；四逆散免煎颗粒（柴胡、枳实、芍药、炙甘草各6g，北京康仁堂药业有限公司）；逍遥散免煎颗粒（柴胡、当归、白芍、白术、茯苓、生姜各15g、薄荷、炙甘草各6g）；柴胡疏肝散免煎颗粒（柴胡、陈皮各6g，川芎、香附、枳壳、芍药各4.5g，炙甘草1.5g）；秋水仙碱（北京普博欣生物科技有限责任公司）。

NE、E、DOPAC、DA、5-HIAA、HVA、5-HT标准品（Sigma公司）；甲醇（色谱纯，Fisher Scientific）；二正丁胺（BAS进口分装，上海化学试剂）；B8离子对试剂（天津化学试剂二厂），；高氯酸（HCLO4）、乙酸钠、柠檬酸、乙二胺四乙酸钠（分析纯，国药集团化学试剂北京有限公司）；超纯水（北京中医药大学科研实验中心）。

1.3 主要仪器 Alliance2695高效液相色谱仪；ECD2465电化学检测器：玻碳工作电极和银／氯化银（Ag／AgCl）参比电极；高速冷冻离心机（Thermo science，美国）；JY88-ⅡN超声细胞粉碎机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；KQ-250DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；PHS-3B精密PH计；MA240D型电子分析天平；DECADEIISDC型电化学检测器（ANTEC公司，荷兰）；Olympus 2700全自动生化分析仪。

1.4 CCl4诱导的大鼠肝纤维化模型的制备与分组处理 60只SD大鼠采用随机数字表法随机分为正常对照组20只，模型组40只。模型组大鼠皮下注射40%CCl4／花生油溶液0.3ml／100g，每周两次，首剂0.5ml／100g；正常组大鼠以同样方法注射等量花生油。根据宏观表征采集、行为学实验、大鼠抓力测试进行证候属性判别，造模4w后从造模大鼠中筛选出典型肝气郁结证大鼠，根据随机数字表随机分为证候模型组、四逆散组、秋水仙碱组；未出现肝气郁结证的造模大鼠为非证候模型组。造模4w后开始灌胃给药，1次／d，6d／w。四逆散组大鼠给予ml－1·kg－1·d－1剂量的四逆散灌胃给药，秋水仙碱组大鼠给予ml－1·kg－1·d－1剂量的秋水仙碱灌胃给药0.002g／kg／d。其他3组大鼠给予等剂量的生理盐水灌胃。以正常对照组、证候模型组、非证候模型组及各治疗组造模12w的肝纤维化肝气郁结证大鼠的血清和组织样本为测量对象。

1.5 血清指标测定 将血清稀释后按全自动生化仪使用说明进行操作测定ALT和AST指标；ELISA试剂盒严格按产品说明书操作，测定稀释后血清中IV-C、LN、HA、TGF-b、CRH、ACTH、CORT、ANG-II、HCY、NE、ACH、5-HT含量。

1.6 高效液相色谱法检测下丘脑内单胺类神经递质

1.6.1 蛋白沉淀剂及标准品溶液的配制 精确称量试剂配置0.1mol／L高氯酸溶液，内含0.3mmol／c乙二胺四乙酸二钠，0.5mmol／c亚硫酸钠。精密称取NE、DOPAC、DA、5-HIAA、HVA、5-HTNE标准品适量，以0.1mol／L高氯酸溶液溶解，配成浓度为100μg／ml的储备液，4℃避光保存。

1.6.2 样品处理方法 将含脑组织样品的EP管从－80℃冰箱中迅速取出，置入冰盒，迅速加入3倍体积的0.1mol／L高氯酸溶液，脑组织在冰浴中以超声细胞粉碎机进行匀浆10秒，组织充分混匀，无碎块及成团组织后，静置10min，高速冷冻离心（12000r／min，10min，4℃），吸取上清再以同样转速时间离心后，吸取上清作为待测样品。

1.6.3 色谱条件 色谱柱：Atlantis C18色谱柱（2.1×150mm，3μm）；流动相：50mM柠檬酸－乙酸钠，pH3.5，内含1mMB8离子对试剂，4%甲醇，1.8mM二正丁胺，0.3mM Na2EDTA。流速：0.35m l／min；柱温：35℃；检测电压：＋0.75V；每次进样量：20μL。1.6.4 样品测试 每次测试前将混标（NE、E、DOPAC、DA、5-HIAA、5-HT和HVA）1ppm进样20μL，进行质控。样品标准曲线测试：分别以0.001、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、1.5、2ppm浓度，20μL进样，记录峰面积。以混标浓度为X轴，色谱峰面积为Y轴建立7个标准曲线，通过该标准曲线，以外标法定量计算样品浓度。

1.7 统计学方法 采用SPSS 17.0统计软件进行分析；计量数据采用均数±标准差的形式表示；统计方法：多组比较时选用两因素析因设计资料的方差分析（ANOVA）和最小显著性差异法（LSD），P＜0.05认为有统计学意义。

2.结果

2.1 各组大鼠血清ALT和AST检测结果 见表1。

表1 各组大鼠血清ALT和AST比较 （±s，IU／mL）

表1 各组大鼠血清ALT和AST比较 （±s，IU／mL）

与正常组比较，★P＜0.05；与模型组比较，●P＜0.05

n AST ALT正常组12 162.42±43.51 64.83±20.78模型组9 1354.33±471.88★861.11±563.40★柴胡疏肝散组9 938±529.67★●523.11±298.08★●四逆散组8 856.13±441.68★●541±251.01★●秋水仙碱组10 756±481.57★●494.4±144.75★●逍遥散组10 1007.3±504.15★●502±196.93★●

2.2 各组大鼠血清中各指标检测结果 见表2、表3。

表2 各组大鼠血清IV-C、LN、HA、TGF-b、ACH、5-HT含量比较 （±s，ng／mL）

表2 各组大鼠血清IV-C、LN、HA、TGF-b、ACH、5-HT含量比较 （±s，ng／mL）

与正常组比较，★P＜0.05；与模型组比较，●P＜0.05

n IV-C LN HA TGFb ACH 5-HT正常组12 96.79± 2.56 46.59± 1.54 232.23± 18.90 223.08± 28.07 65.19± 10.34 24.18± 9.57模型组9 120.27± 23.88★69.71± 35.52★385.12± 66.16★540.92± 150.93★65.61± 17.46 39.54± 12.05★非模组8 106.43± 2.80●47.02± 0.81●224.42± 48.31●312.32± 44.63★●109.89± 57.42★39.131± 10.93柴胡疏肝散组9 104.79± 2.24●48.67± 2.46●252.84± 55.60●412.15± 141.92★●65.77± 12.72 42.04± 19.14★四逆散组8 104.94± 3.60●48.96± 1.89●248.00± 58.70●436.75± 100.10★●92.08± 67.45 36.11± 14.07★秋水仙碱组10 106.98± 3.89●47.83± 3.45●292.57± 38.14★●363.68± 95.23★●97.99± 40.84 34.07± 11.38★逍遥散组10 107.64± 2.38●49.71± 4.20●256.70± 53.06●353.17± 71.06★●77.84± 15.92 33.16± 11.22

表3 各组大鼠血清CRH、ACTH、CORT、ANG-II、HCY、NE含量比较 （±s，ng／mL）

表3 各组大鼠血清CRH、ACTH、CORT、ANG-II、HCY、NE含量比较 （±s，ng／mL）

与正常组比较，★P＜0.05；与模型组比较，●P＜0.05

n CRH ACTH CORT ANG-II HCY NE正常组12 13.35± 2.42 80.42± 13.46 7.62± 1.13 0.60± 0.14 2.02± 1.08 24.82± 6.70模型组9 19.07± 4.39★89.76± 15.53 11.23± 3.93★1.15± 0.78★2.09± 1.01 50.93± 16.61★非模组8 17.34± 4.86 108.16± 24.40★11.84± 2.36★0.39± 0.16●1.85± 1.61 48.40± 13.39柴胡疏肝散组9 18.39± 5.73★91.37± 26.67 10.42± 2.60 0.57± 0.33●2.73± 1.67 49.34± 25.88★四逆散组8 18.28± 5.94★93.83± 28.94 10.13± 1.40 0.43± 0.27●2.65± 2.77 48.54± 22.76★秋水仙碱组10 18.55± 4.97★86.76± 17.35 11.46± 2.70★0.57± 0.46●1.59± 0.85 43.55± 17.20逍遥散组10 18.39± 3.55★78.50± 14.41 9.27± 0.89 0.53± 0.32●2.38± 0.84 35.592± 7.94●

2.3 高效液相色谱法测大鼠下丘脑神经递质含量结果 用0.001μg／mL，0.005μg／mL，0.01μg／mL，0.02μg／mL，0.05μg／mL，0.1μg／mL，0.2μg／mL，0.5μg／mL，1.0μg／mL，1.5μg／mL，2.0μg／mL浓度的复合标准液为检测标准品，分别通过NE、E、DOPAC、DA、5-HIAA、5-HT和HVA测定的峰面积为横坐标，浓度为纵坐标，进行线性回归分析并计算相关系数R2，所得的回归方程如下：

在设置的相关电化学检测电势条件下，NE、E、DOPAC、DA、5－HIAA、5－HT和HVA检测标准曲线的相关系数R2均大于0.99，标准曲线线性良好，可用于样品的分析。各指标结果见表4。

表4 各组大鼠下丘脑单胺类神经递质含量比较 （±s，ng／mL）

表4 各组大鼠下丘脑单胺类神经递质含量比较 （±s，ng／mL）

与正常组比较，★P＜0.05；与模型组比较，●P＜0.05

n NE DA 5-HIAA 5-HT HVA DOPAC正常组9 0.1238± 0.0452 0.0454± 0.0113 0.049± 0.0102 0.1239± 0.0693 1.7581± 0.4341 0.047± 0.0067模型组10 0.1877± 0.0469★0.0577± 0.0093★0.073± 0.0157★0.2403± 0.0979★2.495± 0.5561 0.049± 0.0048★非模组9 0.1776± 0.0486 0.0556± 0.011 0.08± 0.0174★0.2789± 0.1223★2.5975± 0.5939 0.047± 0.0041柴胡疏肝散组9 0.1693± 0.0791 0.0564± 0.0165★0.073± 0.024★0.2778± 0.1578★2.2722± 0.8957 0.056± 0.0157★●四逆散组7 0.2164± 0.1264★0.0506± 0.0125 0.068± 0.02★0.1863± 0.1052 2.3086± 0.4784 0.05± 0.0059秋水仙碱组7 0.1711± 0.0306 0.0559± 0.0138★0.068± 0.0162★0.2315± 0.1138★2.0818± 0.2485 0.05± 0.0055逍遥散组8 0.251± 0.0973★0.0605± 0.0169★0.058± 0.0114 0.2402± 0.0741★1.8913± 0.3426 0.054± 0.0009

3.讨论

本实验中涉及的蛋白水平标志物主要分为以下大类，肝纤维化标志物，脑血管轴、脑肠轴、神经内分泌轴标志物。肝纤维化标志物包括ALT、AST、IV-C、LA、HA、TGF-b；脑血管轴中包括ANG-II，NE，HCY；脑肠轴有5-HT，神经内分泌轴有多巴胺，乙酰胆碱、促肾上腺皮质激素释放素、高香草酸3，4-二羟基苯乙酸，5-羟吲哚乙酸等。

肝纤维化标志物：随着肝纤维化进展，以上的标志物含量均显著高于正常组和各治疗祖，进一步的证明动物模型的成功建立，以及方剂反证的效果。有文献指出［1］，肝气郁结证（肝郁脾虚证），肝纤维化标志物比正常值约升高1.5～2.2倍，随着中医证候向肝肾阴虚、瘀血阻络证发展，这些肝纤维化的标志物比正常值的升高倍数还会继续增加。本实验中，IV-C比正常值约高1.23倍，LN比正常值约高1.48倍，HA比正常值约高1.65倍，也可以一定程度上佐证本实验中大鼠处于肝纤维化肝气郁结证。同时，本实验中证候模型组比非证候模型组肝纤维化标志物显著性升高，用此模型研究肝藏血和肝疏泄功能具有一定可信度。

脑血管轴标志物：ANG-II通过收缩全身小血管而升高血压，对于维持血压起到重要的作用；同时，ANG-II具有促进肝纤维化进程的作用，可以激活HSCs、促进TGF-B分泌、影响MMPS和TIMPS的平衡等，并且ANG-II与抑郁、焦虑、认知功能有密切关系。很多临床研究发现，肝纤维化肝硬化患者血清中ANG-II含量明显增加；本实验也有一致的趋势，并且各治疗组ANG-II含量均比证候模型组减低。同时，前期研究中发现肝纤维化肝气郁结证大鼠存在肝脏血流速度和血流量增高，脑血流量增加等肝藏血功能异常状态，可能与ANG-II影响血管收缩并且升高血压有关；肝气郁结证具有明显的情志异常，并且情志变化与肝纤维化程度都可以被用以治疗肝气郁结证的方剂抑制，考虑肝纤维化肝气郁结证与ANG-II的异常升高有明显的关系，推测ANG-II与肝藏血主疏泄具有一定关系。

NE是一种由交感节后神经元和脑内肾上腺素能神经末梢合成分泌的神经递质，同时也由肾上腺髓质少量合成分泌，其参与胃肠道运动，NE释放过度可以引起腹泻；并且抑郁症的发生与NE减少有一定关系。陈泽奇等［2］测定30例肝气郁结证患者血浆去甲肾上腺素发现，肝气郁结证患者血浆中NE有升高趋势，并且偏烦躁的患者NE升高明显，考虑肝气郁结证与NE有密切关系。本实验中NE证候模型组异常升高，与该结论一致，佐证NE与肝主疏泄具有一定关系。

同型半胱甘酸血症会导致人体产生认知障碍，同时引起焦虑样行为。在本实验中，各组大鼠血清HCY无统计学差异，推测在本模型中，HCY与肝藏血主疏泄功能关系不密切。

脑肠轴：5-HT是重要的神经递质，有研究指出，肝硬化病人血液中5-HT含量增加，与血小板的释放有关，并且5-HT可以促进肝纤维化的发展。本实验中模型组及治疗组血清5-HT均显著高于正常组，与临床研究一致。而大脑中的5-HT作为神经递质，主要分布在下丘脑和松果体，参与痛觉、睡眠和体温调节。本实验中，血清中和下丘脑中5-HT均呈上升趋势，考虑跟肝纤维化肝气郁结证时，由于肝失疏泄不能调畅情志，影响副交感神经敏感及肠神经系统敏感性增高而导致5-HT分泌增加，从而引起大鼠情志变化以及腹泻，推测5-HT的持续升高与肝失疏泄肝气郁结证发生有关，5-HT含量异常与肝主疏泄关系密切。

CRH-ACTH-CORT通路调节异常与抑郁症有关，本实验中，CRH、CORT含量有明显上升，ACTH证候模型组与正常组相比变化不明显，但非证候模型组比证候模型组显著增高。现代研究认为，CORT升高可以引起情绪不稳、烦躁，而CRH和ACTH作为CORT的上游激素，动态调节CORT的含量。在本实验中，证候模型组大鼠具有明显的情志变化，考虑该激素轴含量变化与肝脏病变时与以上通路的激素异常合成和灭活有关，并且与肝气郁结证的情志变化密切相关。该通路的兴奋性神经递质有ACH和5-TH，其中ACH变化不明显，而5-HT呈上升趋势。5-TH的持续增高可能是激活CRH-ACTH-CORT的信号分子之一。

DA是下丘脑和脑垂体中重要得的神经递质，研究证明DA与精神因素明显相关，本实验证候模型组大鼠下丘脑DA增加，与已发现的大鼠情志变化应该有一定关系。5-HIAA是5-HT的终产物，其含量与阵痛和睡眠有一定关系，有实验研究表明5-HIAA降低与抑郁症有关，DOPAC是一种儿茶酚胺类神经递质，HVA是NE和E的终产物，中枢中HVA无明显变化，外周血和脑组织中NE均有不同程度的增加，提示NE代谢异常与肝气郁结证组有一定关系。综合多种脑部神经递质含量有升高趋势，本实验中大鼠肝气郁结证情志变化可能属于偏烦躁型。

中医认为气属阳，血属阴，肝藏血偏于阴，主疏泄偏于阳，阴血不足则不足以涵阳，肝气郁结证早期情绪变化往往偏抑郁，但是后期因为阴血不足，虚热内生，可以以出现情绪烦躁、急躁易怒等症状，临床也可见肝气郁结证患者存在抑郁型情绪变化和烦躁型情绪变化，在临床上可能与个人素体体质、病程长短、疾病严重程度相关。本实验中，肝纤维化肝气郁结证大鼠在藏血功能上存在功能失常，在前期研究中发现，肝纤维化肝气郁结证大鼠存在脑部血流量明显增加，脑部神经递质含量升高，调节情绪的中央杏仁核存在功能异常激活，都与肝失疏泄引起的情志异常密切相关，考虑这些异常改变从宏观的调控到微观蛋白调控存在一定的共同作用，共同引起肝藏血主疏泄功能的失常；推测这些宏观调控和微观指标都是肝藏血主疏泄的相关病生理基础。

综上，本实验中肝纤维化标志物、ANG-II、5-HT、NE、CRHACTH-CORT轴等指标与肝纤维化肝气郁结证大鼠关系较为密切，与肝藏血主疏泄有一定关系。进一步实验的过程中可开展更多血清蛋白标志物的分析检测，以更好的诠释相关动态性变化的生物学机制。

［1］ 罗国钧，罗海琳.慢性肝病肝郁脾虚证的研究进展［J］.山西中医，2001，17（3）：57－59.

［2］ 陈泽奇，金益强，陈国林.肝气郁结证血浆去甲肾上腺素和肾上腺素测定结果分析［J］.中医药学报，1997，25（5）：47－48.

Study the relationship between liver qi stagnation and liver stores blood in liver fibrosis rats

YAN Jing-lu，XUE Xiao-xing，WANGWei，et al.Beijing university of traditional chinesemedicine（Beijing，100029）China.

Objective：To explore the biologicalmechanism of“liver storing blood and Liver Controlling Disper”.Methods：The rat liver fibrosismodelwas established by subcutaneous injection of carbon tetrachloride；The functionalmagnetic resonance imaging and liver ultrasound were used to detect brain and liver blood flow velocity，the vein diameter and blood flow in the model rats.Results：The test result shows that vein diameter and blood flow of the hepatic artery and hepatic vein，the blood flow of hippocampus and hypothalamus were increased in liver fibrosis.Also abnormal activation of brain amygdala was found in brain functionalmagnetic analysis.Conclusion：The results were proved to relate to“liver storing blood“theory closely.The abnormal function of“liver storing blood”was closely related to the hemodynamics changes of liver and brain.

liver fibrosisrat；syndrome of liver Qi stagnation；liver stores blood；serum protein markers.

10.3969／j.issn.1005－0264.2017.02.011

2016－07－07 编辑：黄育华）

国家“十二五”973项目（No.2011CB505106）；△通讯作者，E-mail：wang wei26960＠126.com