热休克蛋白90参与糖皮质激素及其受体对气道黏蛋白5AC表达调控的机制分析

2017-07-01李波

河南医学研究 2017年10期

李波

(焦作市第二人民医院神经内科河南焦作 454150)

李波

(焦作市第二人民医院神经内科河南焦作 454150)

目的探究分析热休克蛋白90参与糖皮质激素及其受体对气道黏蛋白5AC表达调控的机制。方法在六孔培养板上培养四份气道上皮细胞株BEAS-2B，标记为A、B、C、D，其中A组作为单纯对照组，B组加入DEX，C组加入GA，D组先加入GA，再加入DEX，比较4组MUC 5AC的含量,糖皮质激素受体(GR)的核蛋白表达和GR结合活性。结果 B组的糖皮质激素受体(GR)的核蛋白表达和MUC 5AC水平明显低于A组，而GR结合活性明显高于A组；C组的糖皮质激素受体(GR)的核蛋白表达和MUC 5AC水平明显高于B组，而GR结合活性明显低于B组；D组的糖皮质激素受体(GR)的核蛋白表达和MUC5AC水平明显低于B组，而GR结合活性明显低于B组，差异有统计学意义(P<0.05)。结论热休克蛋白90可参与糖皮质激素及其受体对气道黏蛋白5AC表达，是通过降低GR的结合活性来调控糖皮质激素的。【关键词】热休克蛋白90；糖皮质激素及其受体；气道黏蛋白5AC

糖皮质激素广泛应用于呼吸系统疾病的治疗中，通过与糖皮质激素受体结合达到抑制MUC 5AC表达的作用，从而达到治疗效果[1-2]。但是关于相关机制研究很少，本研究对GR作用发挥中起着重要作用的热休克蛋白90(heatshock protein 90，HSP90)与糖皮质激素及其受体对气道黏蛋白5AC表达调控的机制进行研究，分析其相关机制。

1 资料与方法

1.1 材料与试剂人气道上皮细胞株、RPMI-1640培养液、羟乙基哌乙硫磺酸(HEPES)缓冲液、总RNA抽提试剂(Trizol)、小牛血清、地塞米松及放射性标记配体3H-DEX、格尔德霉素(geldanamycin，GA)、兔抗GR单克隆抗体(上海田源生物技术有限公司提供)、鼠抗MUC 5AC单克隆抗体(巨能世纪信息科技(苏州)有限公司提供)、鼠白血病逆转录酶(MMLV，由上海瑞齐生物科技有限公司提供)，相应检测试剂盒均由北京奇松生物科技有限公司提供。

1.2 实验方法本次研究采取重复实验方式进行，培养10份样本细胞进行重复实验，实验结果数据取10份样本研究结果的平均值。

将BEAS-2B细胞放入六孔培养板中，加入含有10%小牛血清的RPMI-1640培养液进行细胞培养，培养过程中培养箱温度要保持在37 ℃、二氧化碳浓度为5%，常规换液，直到细胞融合至75%后进行传代处理，并将细胞浓度调整至2×105 cells/ml。细胞培养完成后将其分为A、B、C、D 4组，其中A组作为单纯对照组，将细胞继续放在培养液中培养；B组加入DEX 100 nmol/L；C组加入GA 1 μmol/L，D组先加入GA 1 μmol/L，24 h后再加入DEX 100 nmol/L。培养24 h后测定4组的相关指标水平。实验中根据每组的实际情况加入放射性标记配体3H-DEX。

采用酶联免疫吸附测定法检测细胞中MUC 5AC蛋白含量，收集培养液中的上清液在40 ℃的96孔反应板上进行检测。

采用荧光定量测定法检测MUC 5AC mRNA，使用总RNA抽提试剂提取各组细胞的总RNA，参照相应试剂盒相关规定对各组的MUC 5AC mRNA进行检测。

采用蛋白质免疫印迹(Western Blot)法检测GR核蛋白表达，首先提取各组细胞的核蛋白。按照电泳、转移(转膜缓冲液平衡、膜处理、转膜)的顺序检测GR核蛋白表达。

采用放射配体结合实验测定GR结合活性。具体方法严格按照相关规定进行。

1.3 观察指标观察比较各组细胞的MUC 5AC的含量，GR的核蛋白表达(GR nuclear protein)和MUC 5AC mRNA。

2 结果

与A组相比，B组MUC 5AC mRNA和蛋白的表达降低，GA对二者无明显作用；D组与B组相比，MUC 5AC mRNA和蛋白的表达水平明显增高。B组GR核蛋白的表达高于A组，而D组与B组相比，GR核蛋白的表达明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。与A组相比，C组GR核蛋白的表达无明显作用，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。