梅丽娜 宁启鹏 赵 清 吴孝立 杜 英⋆

Notch1基因在妊娠期合并高血压孕妇胎盘组织中的表达及相关研究

梅丽娜 宁启鹏 赵 清 吴孝立 杜 英⋆

目的 探讨Notch1基因在妊娠期高血压（妊高症）、重度子痫前期及正常胎盘组织中的表达水平及其相关的临床意义。方法 分别采用免疫组化和荧光实时定量PCR检测50例妊高症、30例重度子痫前期及50例正常胎盘组织中Notch1基因的表达情况。结果 免疫组化检测Nocth1蛋白在妊高症组、重度子痫组及正常对照组中的表达率分别为52.0%、43.4%、76%，组间比较差异均有统计学意义（P＜0.05）；荧光实时定量PCR检测Notch1基因mRNA含量在妊高症组、重度子痫组及正常对照组中分别为（4.10±0.57）、（3.07±0.45），（4.88±0.70），组间比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。结论 Notch1基因的低表达与妊娠期高血压的发生、发展存在相关性。

Notch1 妊娠期高血压 重度子痫前期 荧光实时定量PCR 免疫组化

妊娠期高血压疾病是妊娠和血压升高并存的一组疾病，发生率为5%～12%。该组疾病严重影响母婴健康，是孕产妇和围生儿病死率升高的主要原因。随着二胎政策的开放，越来越多的孕产妇面临着妊娠高血压带来的风险［1-2］。研究表明，妊娠期高血压是由广泛血管内皮损伤，血管内活性物质失衡引起的严重病理生理改变［3］。而近年来有研究发现，Notch 信号通路异常表达可引起组织细胞发育异常，可影响血管的生成和“重铸”，甚至在早期胚胎发育及胎盘的血管形成中也占有重要的作用［4-5］。因此妊娠期高血压的发生与Notch信号通路密切相关。作者通过免疫组化与RTPCR技术检测Notch1信号转导通路在不同胎盘组织中的表达情况，结合相关的临床病理资料，进一步探讨与妊娠期高血压发生、发展的关系。

1 临床资料

1.1 一般资料 收集2012年11月至2014年2月本院妊高症及重度子痫前期产妇胎盘组织80例，妊娠期高血压及重度子痫前期诊断及分类标准参照第8版《妇产科学》诊断标准。选择同期无妊娠合并症择期剖宫产分娩产妇胎盘组织50例为对照组，年龄22～41岁，平均28.9岁。孕周26～42周。所有孕妇均无糖尿病、心脏病、脑血管疾病、免疫系统疾病、甲状腺功能亢进、甲状腺功能减退、慢性肾病等相关病史，孕期无特殊用药史。

1.2 方法 （1）标本采集：所有标本均经医院伦理委员会批准，患者签署知情同意书。患者剖宫产术中胎盘娩出后，立即在胎盘母体面正中近脐带处取约250～500mg的组织，避开出血、坏死组织及钙化部位，立即置入液氮浸没以便迅速降温，液氮运输。（2）提取：Total总 RNA的提取按R mirVana-RNA Isolation Kit（Applied Biosystem p/n AM1556的试剂盒进行操作）。（3）颈环逆转录引物及荧光探针引物设计与合成 数据库中各目的基因的序列（NM_017617），引物由ABI公司的Primer Express Software v2.0设计并合成；DEPC由美国Sigma公司生产。在共焦显微拉曼光谱仪（Renishaw 1000）上检测荧光。逆转录过程严格按照试剂盒进行（由Invitrogen提供）。上游引物为：TCCAGCAGTCTCCGTCCGTG，下游引物为：GGACCCGCCCACAGTGAAAT。（4）特异mRNA的荧光定量PCR技术的建立及优化荧光PCR：采用ABI Vii7 real-time PCR system实时检测荧光强度的变化。PCR反应体系：H2O 6.4μl，KAPA SYBR FAST Qpcr Master Mix（2×）8μl，Primer（up10pM/μl）0.2μl，Primer（down10pM/μl）0.2μl，Template（反转录产物，即cDNA）1μl，ROX0.2μl。反应条件为95℃预变性2min，94℃变性 8s，60℃ 退火10s，72℃ 延伸45s，循环55次，最后72℃ 终末延伸10min，4℃保存后再分析结果。扩增完毕后根据荧光曲线计算相对比值。（5）癌组织及正常组织mRNA的检测：在共焦显微拉曼光谱仪（Renishaw21000）上检测荧光。激发光源为氩离子激光器的488nm线，检测方式是背反式。

1.3 统计学方法 采用SPSS 17.0统计软件。正态分布的计量资料以（x±s）表示，采用F和t检验，计数资料用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 免疫组化结果 Notch1蛋白在不同胎盘组织中的表达情况见图1。Notch1蛋白在不同胎盘组织中的强阳性表达率。见表1。

图1 Notch1蛋白在不同胎盘组织中的表达

表1 三组Notch1免疫组化表达率（n）

2.2 实时定量PCR结果 总RNA提取经电泳扫描分析可见清晰完整的两条条带，所提取的RNA符合实验要求。根据内参，建立Notch1的标准曲线。Notch1基因在妊娠期高血压组胎盘组织、重度子痫前期组胎盘组织和正常对照组胎盘组织中的表达情况见表2。

表2 Notch1 mRNA在三组胎盘组织中的表达（x±s）

3 讨论

Notch基因首次发现于1917年，其突变能造成果蝇的残翅，1983年Artavanis Tsakonas研究组完善相关研究并首次克隆了该基因［4］。Notch信号通路在进化上相对保守，其家族的受体和配体通过局部细胞间的相互作用来调节无脊椎和脊椎动物个体的发育［5-6］。目前大量实验研究证实Notch信号转导通路在神经细胞发育、胚胎发育、T细胞形成、维持造血干细胞的自我更新、肿瘤细胞形成及血管生成中均起着重要作用，其中尤以肿瘤细胞形成和血管生成方面研究较多［7-8］。Notch信号在血管的发生发展，包括细胞增殖、分化、迁移，平滑肌分化，血管生成，动静脉分化等多个方面有重要调控功能［9-11］。Jahnsen等［12］对早期胚胎流产的组织中 Notch-1蛋白的研究中发现了 Notch-1蛋白可以调节信号转导，在胚胎早期发育、着床及胎盘血管侵袭中占有非常重要地位。Cormier等［13］研究报道，除去卵黄囊和胎盘中Notch受体的小鼠，可发生严重血管形成及重塑障碍从而导致胚胎早期致死；而在内皮细胞表达过多的小鼠则发现与Notch-1/4蛋白受体双基因敲除小鼠类似的结果，表明Notch信号通路在胎盘的形成过程中非常重要，在早期胚胎发育的血管形成中起关键作用。

本资料显示，Notch1基因表达水平在妊娠期高血压胎盘组织及重度子痫前期患者胎盘组织中的表达呈下降趋势，差异有统计学意义。这表明随着疾病的发生，Notch1基因的表达水平逐渐下降，Notch1基因参与了在妊娠高血压的早期发生过程，对妊娠合并高血压的早期预防及后期治疗具有重要意义。同时研究认为［4］，Notch1基因的表达状况与有关生物学标记物的关系，Notch1基因的mRNA的表达量随着年龄的增加逐渐下降，分别为（4.87±3.51）（＜35周岁孕产妇）和（4.12±2.56）（＞35周岁孕产妇）；同时，伴发围生期不良结局的胎盘表达量更是显著降低至（3.15±0.78）。这些下降趋势表明Notch1基因在妊娠高血压的演变过程中亦起到非常重要的作用。虽然Notch1mRNA的低表达与患者年龄及产后不良结局具有相关性，但其表达的统计学意义可能受限于样本量的缺乏，还有待扩充样本量进一步加深研究。

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Objective To study the expression of Notch1 gene in hypertensive disorder complicating pregnancy（pregnancy-induced hypertension），severe preeclampsia and normal placenta and its clinical significance. Methods The expression of Notch1 gene in 50 cases of pregnancy-induced hypertension，30 cases of pre-eclampsia and 50 cases of normal placenta were detected by immunohistochemistry and real-time quantitative PCR. Results The expression of Nocth1 protein in PIH group，severed eclampsia group and normal control group were 52.0%，43.4% and 76% respectively. There was signif i cant difference between the two groups（P＜0.05）.The mRNA levels of Notch1 mRNA in PIH group，severe eclampsia group and normal control group were 4.10 ± 0.57，3.07 ± 0.45 and 4.88 ± 0.70 respectively. There was signif i cant difference between the two groups（P＜0.05）. Conclusion The low expression of Notch1 mRNA is associated with the development of PIH.

Notch1 Pregnancy-induced hypertension（PIH） Severe preeclampsia Real-time quantitative PCR Immunohistochemistry

浙江省人口及计划生育项目（浙人口计生委［2011］50号）

313000 浙江省湖州市妇幼保健院

*通信作者