付湘晋,刘 颖,李忠海,林亲录,Tyre C. Lanier

(1.长沙环境保护职业技术学院环境科学系,湖南长沙 410004;2.中南林业科技大学食品科学与工程学院,湖南长沙 410004;3.北卡州立大学食品生物工程与营养科学系,美国北卡罗来纳州,罗利 27695)



鱼糜中活泼羰基化合物在胶凝过程中的变化

付湘晋2,3,刘 颖1,*,李忠海2,林亲录2,Tyre C. Lanier3

(1.长沙环境保护职业技术学院环境科学系,湖南长沙 410004;2.中南林业科技大学食品科学与工程学院,湖南长沙 410004;3.北卡州立大学食品生物工程与营养科学系,美国北卡罗来纳州,罗利 27695)

本文采用五氟苯肼原位衍生化-固相微萃取-气相/质谱法检测了鲢鱼鱼糜、冷冻鱼糜及鱼糜凝胶中的三种活泼羰基化合物(RCCs):丙二醛(MDA)、4-羟基-己烯醛(HHE)、4-羟基-壬烯醛(HNE);并采用添加五氟苯肼清除RCCs,阻断RCCs-蛋白质反应,分析鱼糜中RCCs对鱼糜蛋白胶凝特性的影响。结果表明:新鲜鲢鱼糜中MDA(0.42±0.02) mg/kg、HHE(0.21±0.03) mg/kg含量高于HNE(0.07±0.00) mg/kg;冷冻鱼糜RCCs含量高于新鲜鱼糜,MDA、HHE、HNE含量分别为(1.14±0.03)、(0.86±0.03)、(0.18±0.02) mg/kg。新鲜鱼糜加热胶凝后,各RCC含量均显著上升(p<0.05),冷冻鱼糜加热胶凝后,各RCC含量均显著(p<0.05)下降;添加RCCs清除剂阻断RCCs-蛋白质反应后,冷冻鱼糜凝胶(40 ℃1 h-90 ℃30 min)强度从(243.52±25.04) g×cm下降到(190.53±20.33) g×cm(p<0.05);所以,RCCs加强了冷冻鱼糜凝胶的强度。RCCs对鱼糜凝胶的保水性无明显影响。

鱼糜,凝胶,活泼羰基化合物,丙二醛,4-羟基-己烯醛,4-羟基-壬烯醛

活泼羰基化合物(Active carbonyl compounds,RCCs)主要指α,β-不饱和醛、酮醛、二元醛,如丙烯醛(ACR)、4-羟基-己烯醛(HHE)、4-羟基-壬烯醛(HNE)、4-氧代-2-壬烯醛(ONE)、丙二醛(MDA)等,其反应活性非常强,双键能与亲核基团(如半胱氨酸的巯基,组氨酸的咪唑基,赖氨酸、精氨酸的氨基等)发生迈克尔加成反应[1-2],羰基可与游离氨基反应形成希夫碱。在体内,RCCs引起蛋白质结构变化,造起“羰基应激”,与衰老、肿瘤、阿尔茨海默病等均密切相关[3]。在食品中,RCCs引起蛋白质氧化,对食品颜色、风味、质构、保水性等均有显著影响,还参与或促进丙烯酰胺、生物胺、杂环胺等有毒物质的产生[4-6]。

肉类食品中RCCs主要源于多不饱和脂肪酸(PUFA)氧化。鱼肉富含PUFA,极易氧化产生RCCs。黄条鲱冷藏13 d,HHE从500 μg/kg增加到约2100 μg/kg[7];新鲜的秋刀鱼肉中HHE是(1698.8±793.6) μg/kg,在-20 ℃下贮藏3个月增加到6200 μg/kg,12个月增加到12000 μg/kg左右[8]。鱼糜中脂肪含量低于鱼肉,但冷冻鱼糜如果冻藏时间较长,也会发生明显的脂肪氧化[9];目前还未见鱼糜及冷冻鱼糜中RCCs的研究报道。

胶凝是鱼糜最主要的功能特性,RCCs影响鱼糜凝胶特性。李学鹏等报道,ACR可修饰肌原纤维蛋白致肌原纤维蛋白氧化,当ACR浓度大于0.1 mmol/L时,肌原纤维蛋白的凝胶性质劣化,凝胶强度、保水性降低;活性巯基对ACR较为敏感,ACR浓度为0.01 mmol/L时其含量减少了40.8%;电泳表明ACR能使蛋白质发生交联[10]。Zhou等报道,MDA诱导肌球蛋白交联,显著提高肌球蛋白凝胶强度,MDA含量为10 mmol/L时,凝胶强度升高3～4倍[11]。

上述研究均为模拟体系研究,并未有研究实际体系中RCCs对凝胶特性的影响的报道。本论文在鱼糜中添加RCCs清除剂五氟苯肼,阻断RCCs-蛋白质反应,以期能间接反映鱼糜中RCCs对鱼糜胶凝特性的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜鲢鱼肉 约3 kg/尾,2016年1月捕捞自当地池塘,捕捞后1 h内人工宰杀、去头、去皮、去内脏,清洗干净,冰藏,12 h内冰藏运送至实验室采肉,进行鱼糜加工;2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)、五氟苯肼、1,1,3,3-四甲氧基丙烷 美国Sigma-Aldrich，分析纯;4-羟基-己烯醛(HHE)、4-羟基-壬烯醛(HNE) 美国Cayman Chemicals，分析纯;其他试剂 均为分析纯。

TA.XT Plus质构仪 英国SMSTA;Agilent 7890A GC气相-质谱联用仪 美国安捷伦,配5975C质谱检测器,HP-5MS毛细管柱30 m× 250 μm(i.d.)× 0.25 μm;固相微萃取头(涂层为聚二甲基硅氧烷,PDMS) Gerstel(Linthicum,MD,USA)。

1.2 实验方法

1.2.1 鱼糜的制备 新鲜鲢鱼鱼肉加入3倍冷水(4 ℃),搅拌后静置5 min,将上层水倒出,然后用纱布挤压脱水;漂洗3次,最后一次采用0.5%的冷食盐水漂洗。添加6%蔗糖、0.3%多聚磷酸钠,混匀,即得鱼糜[12]。

采用-18 ℃冻藏3个月的冷冻鱼糜为样品,研究冻藏对鱼糜中RCCs的影响。

1.2.2 鱼糜胶凝的制备 将鱼糜在1500 r/min下擂溃,空擂2 min后加冰调整最终水分含量至78%,加入3%食盐盐擂4 min;整个过程保持物料温度在10 ℃以下[13]。

擂溃时在鱼糜中添加2 mg/kg五氟苯肼阻断RCCs-蛋白质反应,与未加五氟苯肼的鱼糜凝胶比较凝胶强度、凝胶保水性,分析RCCs对凝胶特性的影响。

擂溃好的鱼糜灌装到不锈钢管(20 mm×150 mm)中,采用水浴加热,3个加热程序:40 ℃ 1 h-90 ℃ 30 min;60 ℃ 30 min-90 ℃ 30 min;90 ℃ 30 min;分别记为G40、G60、G90。加热后,立即自来水冷却,冷却至室温后,于4 ℃静置12 h;再室温静置2 h,测定凝胶强度、保水性[12]。

1.2.3 RCCs的测定 主要检测的RCCs包括MDA、HHE、HNE。参考Ruan等的方法[14],以五氟苯肼为衍生化试剂,采用固相微萃取-气相/质谱法(SPME-GC/MS)检测,外标法定量。

1.2.3.1 样品的前处理 将鱼糜及鱼糜凝胶绞碎,取绞碎样品(1±0.05) g,置于10 mL样品瓶,加5 mL蒸馏水,3.5 mL KH2PO4缓冲液(0.5 mol/L,pH4),BHT(1 mmol/L,200 μL),再加200 μL五氟苯肼(5 mg/mL)溶液,漩涡混匀10 min,用固相微萃取纤维插入式吸附60 min(室温)。

1.2.3.2 GC-MS参数 柱温程序50 ℃保温0.5 min,25 ℃/min升温至 150 ℃,再30 ℃/min至280 ℃;载气,氦气(99.999%),1.2 mL/min;电离方式EI,电离电压70 eV,灯丝发射电流为200 μA,离子源温度为200 ℃,接口温度300 ℃,扫描质量范围为33～450 amu。

1.2.4 凝胶强度测定 把凝胶切成25 mm 厚,用质构仪测定凝胶破断强度(g)和凝胶形变距离(cm),金属球形探头S 0.5(直径为5 mm),探头下降速度为6 cm/min[15]。凝胶强度按公式(1)计算:

凝胶强度(g×cm)=凝胶破断强度(g)×凝胶破断形变(cm)

式(1)

1.2.5 凝胶保水性(WHC)测定 取加热制备好的鱼糜凝胶2～3 g,称重W1,室温下5000×g离心10 min,弃去水分,称重W2[16],按公式(2)计算保水性(WHC):

式(2)

1.3 数据处理

所有实验重复3次。用SPSS软件进行数据的显著性分析。

2 结果与分析

2.1 新鲜鱼糜胶凝过程中RCCs的变化

新鲜鱼糜及凝胶中几种主要RCCs的含量见表1。新鲜鲢鱼糜中MDA含量为(0.42±0.02) mg/kg、HHE为(0.21±0.03) mg/kg,含量均高于HNE(0.07±0.00) mg/kg,这是因为鲢鱼糜中ω-3 PUFA含量较高,HHE源自ω-3 PUFA氧化,而HNE源自ω-6 PUFA氧化[7-8]。加热胶凝后,各RCCs含量均有所上升,其中G40上升显著(p<0.05),MDA、HHE、HNE均上升了约50%,可能是因为G40受热时间最长,脂肪氧化最严重[17]。

表1 新鲜鱼糜及其凝胶中RCCs的含量Table 1 The content of RCCs in fresh surimi and its gel

注:表中数据为平均值±标准偏差,n=3,a～b同列中数据的上标字母不同代表有显著差异(p<0.05)。表2～表4同。

2.2 冷冻鱼糜胶凝过程中RCCs的变化

冷冻鱼糜及凝胶中几种主要RCCs的含量见表2。与新鲜鱼糜类似,冷冻鱼糜中MDA(1.14±0.03) mg/kg、HHE(0.86±0.03) mg/kg含量高于HNE(0.18±0.02) mg/kg。与新鲜鱼糜(表1)相比,冷冻鱼糜RCCs含量显著增加(p<0.05),MDA、HHE、HNE分别增加了170%、410%、257%;这是因为冷冻鱼糜虽然在-20 ℃冻藏,但PUFA仍在缓慢氧化[9]。

表3 RCCs对鱼糜凝胶强度(g×cm)的影响Table 3 The effect of RCCs on the gel strength(g×cm)

注:A～B同行中数据的上标字母不同代表有显著差异(p<0.05)。表4同。

表4 RCCs对鱼糜凝胶保水性的影响Table 4 The effect of RCCs on the WHC of gel

加热胶凝后,各RCCs含量均显著(p<0.05)下降,其中90 ℃加热胶凝的凝胶(G90)RCCs的含量下降最明显,MDA、HHE、HNE均下降约50%;这一点与新鲜鱼糜胶凝中RCCs变化完全不同,新鲜鱼糜胶凝后,各RCCs含量增加。

表2 冷冻鱼糜(-18 ℃、3个月)及其凝胶中RCCs的含量Table 2 The content of RCCs in frozen surimi(-18 ℃,3 month)and its gel

冷冻鱼糜胶凝后,其RCCs含量降低是本论文的新发现。鱼糜凝胶中检测到的RCCs含量取决于PUFA氧化生成RCCs的量及与氨基酸、肽、蛋白质反应消耗的RCCs的量[18]。本文测定结果表明,新鲜鱼糜胶凝过程中,RCCs生成量高于消减量,所以凝胶中检测到的RCCs含量高于鱼糜中RCCs含量。冷冻鱼糜则相反,冻藏后,RCCs已经累积较多;加热胶凝时,RCCs与氨基酸、肽、蛋白质反应消耗的量高于这个过程中PUFA氧化产生的RCCs,所以凝胶中RCCs检测量低于冷冻鱼糜。所以,冷冻鱼糜胶凝过程中,有大量RCCs与氨基酸、肽、蛋白质发生了反应。

2.3 RCCs对鱼糜凝胶强度的影响

鱼糜凝胶强度测定结果见表3。G40加热凝胶的强度最高,因为内源转谷氨酰胺酶促进蛋白交联;G60加热凝胶的强度最低,因为内源热稳定组织蛋白酶造成肌原纤维蛋白降解;这与已有的报道一致[19-20]。冷冻鱼糜凝胶与新鲜鱼糜凝胶相比,凝胶强度显著下降(p<0.05),这与蛋白质冷冻变性有关[21]。五氟苯肼对新鲜鱼糜凝胶没有显著影响,但冷冻鱼糜凝胶G40、G90的强度显著降低(p<0.05),G40、G90分别下降约20%、16%。

RCCs-蛋白质反应对凝胶强度的影响可归纳为两个方面:与蛋白质-SH反应则减少凝胶中S-S键交联,造成凝胶强度下降[22-23];RCCs有两个活性基团,如果分别与不同的蛋白质分子加合,则造成蛋白质交联,增强凝胶强度[11,24]。添加RCCs清除剂对新鲜鱼糜凝胶强度影响不大,但显著降低冷冻鱼糜凝胶的强度(表3),这是本论文的新发现。添加五氟苯肼后,RCCs被清除,RCCs参与的蛋白质交联反应被阻断,凝胶中蛋白质交联减少,凝胶强度下降;结合鱼糜及凝胶中RCCs含量变化(表1、表2),冷冻鱼糜中发生的RCCs-蛋白质反应多于新鲜鱼糜,所以添加RCCs清除剂对冷冻鱼糜的影响更大。

2.4 RCCs对鱼糜凝胶保水性的影响

鱼糜凝胶保水性测定结果见表4。G60加热凝胶的保水性最差,显著低于其他两种加热模式(p<0.05);G40和G90加热凝胶的保水性之间无显著差异;冷冻鱼糜凝胶的保水性显著低于新鲜鱼糜凝胶(p<0.05);这些与文献报道一致[12-13]。添加五氟苯肼对鱼糜凝胶保水性无显著影响。鱼糜凝胶的保水性主要由两方面决定:凝胶超微结构,超微结构越致密、均匀,凝胶保水性越好,同时,凝胶强度也越高;蛋白质亲水-疏水特性,蛋白质亲水性与凝胶保水性正相关[13,25]。本文测定结果表明,鱼糜凝胶保水性与凝胶强度(表3)变化趋势基本一致。模拟体系研究结果表明,少量RCCs对凝胶保水性无明显影响,而高含量RCCs显著降低凝胶保水性[10-11]。所以,五氟苯肼对鱼糜凝胶保水性无显著影响可能是因为冷冻鱼糜中RCCs的含量较低。

3 结论

白鲢鱼鱼糜及冷冻鱼糜中MDA、HHE含量高于HNE含量,与新鲜鱼糜相比冷冻鱼糜三种RCCs含量均显著增加(p<0.05)。冷冻鱼糜胶凝后,G90中RCCs含量减少最多,约为50%;添加五氟苯肼,清除RCCs,阻断RCCs-蛋白质反应,冷冻鱼糜凝胶G40的强度下降约20%;这表明RCCs参与了鱼糜胶凝反应,促进了冷冻鱼糜蛋白质交联。而添加五氟苯肼对鱼糜凝胶保水性无显著影响。

[1]Colzani M,Criscuolo A,Maddis D D,et al. A novel high resolution MS approach for the screening of 4-hydroxy-trans-2-nonenal sequestering agents[J]. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis,2014,91:108-118.

[2]LoPachin R M,Gavin T. Molecular Mechanisms of aldehyde toxicity:a chemical perspective[J]. Chem Res Toxicol，2014,27:1081-1091.

[3]Wang C,Weerapana E,Blewett M M. et al. A chemoproteomic platform to quantitatively map targets of lipid-derived electrophiles[J]. Nature Methods,2014,11:79-85.

[4]Zamora R,Alcón E,Hidalgo F J. Strecker-type degradation of phenylalanine initiated by 4-Oxo-2-alkenals in comparison to that initiated by 2,4-Alkadienals,4,5-Epoxy-2-alkenals,or 4-Hydroxy-2-nonenal[J]. J Agric Food Chem,2013,61(43):10231-10237.

[5]Papastergiadis A,Fatouh A,Jacxsens L,et al. Exposure assessment of malondialdehyde,4-Hydroxy-2-(E)-Nonenal and 4-Hydroxy-2-(E)-Hexenal through specific foods available in Belgium[J]. Food and Chemical Toxicology,2014,73:51-58.

[6]Surh J,Kwon H. Estimation of daily exposure to 4-hydroxy-2-alkenals in Korean foods containing n-3 and n-6 polyunsaturated fatty acids[J]. Food Addit Contam,2005,22:701-708.

[7]Sakai T,Matsushita Y,Sugamoto K,et al. Lipid peroxidation-derived hepatotoxic aldehyde,4-Hydroxy-2-hexenal,in fish[J]. Bioscience Biotechnology and Biochemistry,1997,61(8):1399-1400.

[8]Tanaka R,Naiki K,Tsuji K,et al. Effect of antioxidative treatments on lipid oxidation in skinless fillet of pacific sauryCololabissairain frozen storage[J]. J Food Process Pres,2013,37:325-334.

[9]Fu X,Xu S,Wang Z. Kinetics of lipid oxidation and off-odor formation in silver carp mince:The effect of lipoxygenase and hemoglobin[J]. Food Research International,2009,42(1):85-90.

[10]李学鹏,王祺,周凯,等. 丙烯醛氧化对大黄鱼肌肉组织和肌原纤维蛋白结构性质的影响[J]. 现代食品科技,2014,30(10):1-7.

[11]Zhou F,Zhao M,Su G,et al. Gelation of salted myofibrillar protein under malondialdehyde induced oxidative stress[J]. Food Hydrocolloids,2014,40:153-162.

[12]Fu X,Hayat K,Li Z,et al. Effect of microwave heating on the low-salt gel from silver carp(Hypophthalmichthysmolitrix)surimi[J]. Food Hydrocolloids,2012,27(2):301-308.

[13]Stevenson C D,Liu W,Lanier T C. Rapid heating of alaska pollock and chicken breast myofibrillar protein gels as affecting water-holding properties[J]. J Agric Food Chem,2012,60(40):10111-10117.

[14]Ruan E D,Aalhus J,Juárez M. A rapid,sensitive and solvent-less method for determination of malonaldehyde in meat by stir bar sorptive extraction coupled thermal desorption and gas chromatography/mass spectrometry with in situ derivatization[J]. Rapid Commun Mass Spectrom,2014,28:2723-2728.

[15]Fu X,Li Z,Wu Y. Using pH-shifting Process to recover proteins for low salt gel products from silver carp[J]. Advanced Materials Research,2012,556:1285-1289.

[16]Leksrisompong P N,Lanier T C,Foegeding E A. Effects of heating rate and pH on fracture and water-holding properties of globular protein gels as explained by micro-phase separation[J]. Journal of Food Science,2012,77(2):E60-E67.

[17]Kawai K,Matsuno K,Kasai H. Detection of 4-oxo-2-hexenal,a novel mutagenic product of lipid peroxidation,in human diet and cooking vapor[J]. Mutat Res,2006,603:186-192.

[18]Fuentes V,Estévez M,Ventanas J,et al. Impact of lipid content and composition on lipid oxidation and protein carbonylation in experimental fermented sausages[J]. Food Chemistry,2014,147(15):70-77.

[19]Liu H,Yin L,Zhang N,et al. Isolation of cathepsin B from the muscle of silver carp(Hypophthalmichthysmolitrix)and comparison of cathepsins B and L actions on surimi gel softening[J]. Food Chemistry,2008,110(2):310-318.

[20]Paker I,Sarah B,Jaczynski J,et al. The effect of organic acids on gelation characteristics of protein gels made from silver carp(Hypophthalmichthysmolitrix)protein recovered by isoelectric solubilization and precipitation[J]. LWT-Food Science and Technology,2013,53(1):37-43.

[21]MacDonald G A,Lanier T C,Swaisgood H E,et al. Mechanism for stabilization of fish actomyosin by sodium lactate[J]. J Agric Food Chem,1996,44(1):106-112.

[22]Jongberg S,Lund M N,Skibsted L H,et al. Competitive reduction of perferrylmyoglobin radicals by protein thiols and plant phenols[J]. J Agric Food Chem,2014,62(46):11279-11288.

[23]Yang J,Xiong Y L. Inhibition of lipid oxidation in Oil-in-Water emulsions by interface-adsorbed myofibrillar protein[J]. J Agric Food Chem,2015,63(40):8896-8904.

[24]Li C,Xiong Y L,Chen J. Protein oxidation at different salt concentrations affects the cross-linking and gelation of pork myofibrillar protein catalyzed by microbial transglutaminase[J]. Journal of Food Science,2013,78(6):C823-C831.

[25]Liu Z,Xiong Y L,Chen J. Identification of restricting factors that inhibit swelling of oxidized myofibrils during brine irrigation[J]. J Agric Food Chem,2009,57(22):10999-11007.

Effect of gelling on the active carbonyl compounds in surimi

FU Xiang-jin2,3,LIU Ying1,*,LI Zhong-hai2,LIN Qin-lu2,TYRE C. Lanier3

(1.Department of Environmental Science,Changsha Environmental Protectionl College,Changsha 410004,China；2.College of food Science and Engineering,Central South University of Forestry and Technology,Changsha 410004,China；3.Department of Food Bio Processing,and Nutrition Sciences,NC State University,Raleigh 27695,USA)

Three kinds of active carbonyl compounds(RCCs),malondialdehyde(MDA),4-hydroxy-2-hexenal(HHE),and 4-hydroxy-2-nonenal(HNE)in silver carp surimi and gel were determined using situ derivatization-SPME-GC-MS and the pentafluorophenyl hydrazine was the derivative agent. Furthermore,by adding pentafluorophenyl hydrazine to block RCCs-protein reaction,the effect of RCCs on surimi gel was analyzed. The content of MDA(0.42± 0.02) mg/kg,HHE(0.21±0.03) mg/kg were higher than HNE(0.07±0.00) mg/kg in fresh silver carp surimi. The content of MDA,HHE,HNE in frozen surimi were(1.14±0.03),(0.86±0.03),and(0.18±0.02) mg/kg,respectively,which were higher than that in fresh surimi. For gel from fresh surimi,because of heating,RCC content significantly increased(p<0.05),however,for gel from frozen surimi,RCC content significantly(p<0.05)decreased. RCCs had no effect on gel strength of fresh surimi,however,after adding RCCs blockers,gel strength of frozen surimi(40 ℃,1 h-90 ℃,30 min)decreased from(243.52±25.04) g×cm to(190.53±20.33) g×cm(p<0.05),so RCCs helped to enhance the gel strength of frozen surimi. RCCs had no significant effect on water holding capability of surimi gel.

surimi;gel;active carbonyl compounds;malondialdehyde;4-hydroxy-2-hexenal;4-hydroxy-2-nonenal

2016-09-19

付湘晋(1980-)，男，博士，副教授，主要从事水产品深加工及食品安全方面的研究，E-mail:drxjfu@163.com。

*通讯作者:刘颖(1980-)，女，硕士，讲师，主要从事食品深加工方面的研究，E-mail：314721423@qq.com。

国家留学基金(201408430270)；湖南省2011协同创新中心(湘教通[2013]448号)。

TS254.1

A

1002-0306(2017)10-0072-04

10.13386/j.issn1002-0306.2017.10.006