尹作静,曹志伟,闫鑫淼,阳奕琰,盛 振

(同济大学生命科学与技术学院，上海 200092)

黄连素和吴茱萸碱协同抗癌的miRNA网络机制研究

尹作静,曹志伟,闫鑫淼,阳奕琰,盛 振

(同济大学生命科学与技术学院，上海 200092)

目的 从miRNA 及其调控的通路网络水平，研究黄连素和吴茱萸碱产生协同抗癌作用的机制。 方法 先在细胞水平上验证并详细分析了黄连素与吴茱萸碱对肿瘤细胞增殖的抑制作用，确定了二者的剂量效应范围及协同作用产生的浓度配比，然后采用基因表达芯片技术分析了黄连素和吴茱萸碱处理后的肝癌细胞BEL-7402的miRNA表达谱，通过构建miRNA-mRNA互作网络，对二者的协同作用机制进行阐释。 结果 黄连素与吴茱萸碱合用可以明显协同抑制肝癌细胞BEL-7402的增殖能力； 合用后产生的差异miRNA(DEmiRNA) 主要参与MAPK信号通路、内吞通路及胰岛素信号通路等癌症增殖相关通路的调控；合用影响的特异的靶基因既涵盖了通路上游细胞膜上的3类膜受体，又参与到下游信号通路的转导。结论 从miRNA的调控关系可以看出，黄连素可能在两药协同抑癌作用中起着主要的作用。 黄连素和吴茱萸碱在miRNA水平上协同机制的阐释，为今后协同药物组合的发现提供了一种新的思路。

黄连素；吴茱萸碱；联合用药；协同用药；作用机制；KEGG通路；通路网络

癌症，由于其高发病率和高致死率，在参与药物研发的疾病中所占比重逐年增长[1]。在传统的癌症治疗中，“单成分-单靶点”的药物往往由于肿瘤细胞耐药性的迅速产生而逐渐失去疗效[2]，或者由于对机体的毒副作用大，严重影响患者的生存质量而导致治疗效果不佳[3]。而协同药物组合，比单药疗法具有更好的整体治疗效果，并且具有增效减毒，剂量降低的优势，日益受到药物研发人员和临床医生的青睐[4]。

目前关于协同作用机制的研究主要是从药物作用后影响的单个生物学过程如细胞凋亡等来研究，或只考虑了单一的通路上基因表达的变化[5]。2009年，新加坡国立大学Yuzong Chen教授课题组对药物组合进行了归类，并针对每一类药物组合，探索了它们的作用机制。他们的研究指出，药物效应上的协同作用以及药物代谢上的增效作用被认为是有效的药物组合。其中，药物效应上的协同作用主要通过药物靶向到疾病网络的不同位置来实现的[6]。

最近有研究发现，miRNA的表达与多种癌症的发病机制相关[7]，大约50%得到注解的miRNA在基因组上定位于与肿瘤相关的脆性位点，这说明miRNA可能在肿瘤发生过程中起着至关重要的作用[8]。并有研究显示，中药及其成分可以通过影响表达异常的miRNA来调控相应靶基因或靶蛋白，进而诱导肿瘤细胞的凋亡[9]。因为miRNA与其靶mRNA的调控关系是多对多的，不同的miRNA可以通过调控关系与它们的靶mRNA形成特定的网络结构和调节模块，从而相互协同地发挥作用[9]。中药多成分之间可能也会通过调节不同miRNA的表达，从而协同地改变了特异性mRNA的翻译活性，进而产生特定的药理学协同效应。

近年来有研究发现，中药单体化合物黄连素与吴茱萸碱具有多种抗肿瘤作用，包括抑制肿瘤细胞生长、诱导肿瘤细胞凋亡、减少肿瘤的恶性转化和转移等[10]。前期实验研究发现，联合使用这两种中药成分在胃癌等癌症中有明显的协同抗癌效果[11]。然而，其协同抑癌作用机制还不够清楚。

本文主要从黄连素和吴茱萸碱单用及合用于肝癌细胞后miRNA表达水平的变化及其对靶基因的调控，结合KEGG通路网络，从通路网络层面分析两药产生协同作用的分子机制。

1 材料与方法

1.1 细胞培养及药物处理 BEL-7402细胞以5 ×108·L-1培养于10 cm的培养皿中，细胞贴壁生长12 h后，据MTT实验结果，分别加入单药或者合用药物的IC50剂量处理BEL-7402细胞24 h。抽提和纯化RNA，并做miRNA芯片实验。实验分成4组：对照组、黄连素处理组(BER)、吴茱萸碱处理组(EVO)、黄连素和吴茱萸碱合用处理组(BER+EVO)。

1.2 miRNA芯片数据的获得及差异miRNA的筛选 黄连素和吴茱萸碱单用和合用于肝癌细胞BEL-7402后的miRNA芯片，由上海伯豪生物技术有限公司提供。芯片平台是Agilent human miRNA(8×15k) v12.0芯片(design ID：21827)，每组包括4个样本，14 752个miRNA。

归一化后的芯片数据，通过以下参数来筛选差异表达的miRNA：① 倍数差异(Fold Change)：一般写成FC，就是将待比较的两个标准化以后的信号相除得到的数值。即Fold Change = Signal A/Signal B。② 显著性检验：进行统计学t检验，计算P值。③ 每个探针点的Flag值/Call值，表达谱芯片中用A、P、M来表示3种不同的情况：A-Absent，表示该探针点信号与背景信号差异无显著性；P-Present，表示该探针点信号与背景信号差异具有显著性；M-Marginal，表示该探针点的信号与背景的差异介于A和P之间。

本实验确认差异表达miRNA的参数如下：①P<0.05，并且FC>=2或FC<=0.5；② 每个探针点的Flag值设定阈值为至少一组内不出现A。

1.3 差异miRNA对应靶基因的筛选及功能富集 将筛选出的差异的miRNA通过miRWalk软件查找到对应的靶基因。miRWalk软件收集了来自5个数据库的miRNA对应的靶基因信息，分别包括miRWalk、miRanda、Pictar2、RNA2、Targetscan。为了确保查找到的靶基因的准确性，选择至少在4个数据库中被证实的靶基因。

为分析差异miRNA影响的生物学功能，分别将差异miRNA对应的靶基因通过DAVID软件富集到GO生物学过程和KEGG通路中，取FDR<0.01。并对富集的GO生物学过程用DAVID软件中的clustering做聚类分析，对聚为一类的GO生物学过程的FDR值取平均，作为新聚成的GO生物学过程的显著性P值。

为分析合用后影响的通路中的基因组成，分别以合用后影响的4类靶基因(合用特异的靶基因、分别与两药单用共同的靶基因、单用及合用共同的靶基因)与富集通路中基因的交集在通路总基因中所占的比例作为此类靶基因对于该条富集通路的贡献率，比值越大，表示贡献率越大。并对于4类靶基因，取其与某条通路基因的交集与其在所有靶基因中所占的比例做卡方检验，如果P值小于0.05，则认为该通路对靶基因的选择具有偏好性。

1.4 KEGG通路的网络分析 将KEGG中目前存在的所有通路蛋白或基因的调控关系解析出来，针对用药后靶基因富集的几条明显通路，构建通路网络，并联合药物作用后的差异miRNA的调控信息，从通路网络的角度分析两药协同作用的机制。

2 结果与讨论

2.1 两药合用的协同效果分析 由Fig 1看出：黄连素和吴茱萸碱都可以抑制肿瘤细胞BEL-7402的增殖。48 h处理后的IC50值分别为：黄连素57.36 μmol·L-1，吴茱萸碱4.68 μmol·L1。 这一结果表明吴茱萸碱对BEL-7402的毒性作用可能略强于黄连素。另外，根据CI分析，二者合用(黄连素 ∶吴茱萸碱=10 ∶1)情况下，其CI值大部分都小于1，表明二者可以产生协同作用[12]。为了从miRNA水平上解释两药协同作用的机制，本文选用miRNA芯片对药物处理24 h 前后 BEL-7402细胞内miRNA的表达量的变化进行检测。

Fig 1 Influence of drugs on proliferation of liver cancer cell BEL-7402

The left figure stands for the dose-effect relationship. The ratio of berberine and evodiamine is 10 ∶1, and the X axis stands for the dose of berberine. The right figure stands for the CI value of the combination of berberine and evodiamine. If the CI is less than 1, it stands for the synergistic effect

Fig 2 The quality control of miRNA chips

2.2 miRNA芯片的质量分析 为检测miRNA芯片的质量，根据芯片结果，绘制不同处理条件下miRNA平均表达值的散点图，由Fig 2看出，4种不同处理条件下miRNA的平均表达值没有偏离正对角线，表明芯片的质量较高，可以用于后续的分析。

2.3 差异miRNA的筛选和靶基因预测及功能富集 黄连素和吴茱萸碱单用及合用后差异表达的miRNA分别有10、5、32个(其中上调分别为4、4、9个，下调分别为6、1、23个)。 合用后影响的miRNA中有3个(hsa-miR-188-5p，hsa-miR-23b*、hsa-miR-663)是与两药单用重叠的，4个(hsa-miR-1207-5p、hsa-miR-135a*、hsa-miR-572、hsa-miR-630)是与黄连素单用重叠的，而25个是合用新产生的。3种不同处理条件下的差异miRNA列表见Appendix Tab 1。合用特异的差异miRNA如Tab 1所示。

有意思的是，合用后影响的特异miRNA中，有近70%的miRNA的表达量在药物处理后发生了明显的下调。几个典型的miRNA中，hsa-miR-1225-5p经研究证明在胃癌样本中差异表达，并且可以作为胃癌术后的腹膜复发的重要生物标记[13]。hsa-miR-125a-3P可以通过激活p53通路中p53的表达来诱导肺癌细胞的凋亡[14]。这些间接地说明合用后产生的特异的差异miRNA与癌症的发生发展有密切的联系。

由Fig 3可以看出，黄连素单用与两药合用，不论在miRNA水平上，还是靶基因水平上，重叠度都比较高。这说明黄连素可能在两药联合作用时起到了主要的作用，干扰作用更大更广泛。两药合用后，特异性的miRNA占78%，特异性的靶基因占43.9%，这些特异性的差异miRNA和靶基因可能与两药产生协同作用有着密不可分的关系。

Tab 1 The special DEmiRNAs induced by drug combination

Appendix Tab 1 List of DEmiRNAs

The “b” in parentheses stands for DEmiRNA under berberine; the “e” stands for DEmiRNAs under evodiamine; the “c” stands for DEmiRNAs under combination.

Fig 3 The venn plot of DEmiRNAs and target genes under different treatment

为研究两药合用后影响的生物学过程和生物学通路，我们对差异miRNA的靶基因分别进行GO生物学过程和KEGG通路富集分析。由Fig 4A看出，与两药单用相比，合用后特异性地调控了代谢、 微管的发育和形态发生、感觉器官的形成、泌尿和肾脏的发育等生物学过程。研究表明，癌症的发生与某些基础代谢相关，mTORC能够调控肝癌细胞中FGF19的代谢，因此可以作为靶向治疗肝癌的靶蛋白[15]。两药单用和合用都能够对磷酸化、神经的分化与发育等生物学过程产生调控。有研究表明，AKT的抑制剂AZD5363能够通过抑制AKT信号通路下游分子的磷酸化，来抑制肝癌中Hep-G2和Huh-7细胞的磷酸化，从而达到抑制肝癌细胞增殖的目的[16]。有研究表明，神经元-神经胶质抗原的过表达，预示着肝细胞癌预后效果不好，间接说明了肝癌与神经的活动有关[17]。

Appendix Tab 2 The gene preference and gene contributions in pathways

The first column stands for the enriched pathways; the second column stands for the gene preference; the last 4 columns stand for the gene contributions to the pathways.

由Fig 4B看出，在富集的KEGG通路上，合用后明显影响的通路主要包括胰岛素信号通路，轴突信号通路等。特异性影响的通路主要包括Ⅱ型糖尿病，黏着斑，内吞等通路。有研究表明，临床上发现有很多肿瘤都存在通过神经进行局部扩散的现象，并且目前大量的动物实验表明，癌细胞天生就有通过轴突在某种机制下激活迁移的能力[18]。并有研究表明，靶向筛查和治疗丙型肝炎，治疗糖尿病并预防初级肥胖，是降低未来肝癌发病率的关键[19]，间接说明糖尿病与肝癌有一定的联系。有趣的是，合用明显影响的通路也是黄连素单用也可以影响的，说明合用影响的这些通路来自于黄连素的作用。单用和合用共同影响的通路主要包括与癌症发展相关的MAPK信号通路、神经信号通路等。

通过对合用影响的通路基因偏好性及基因贡献率的分析(Appendix Tab 2)，发现合用明显影响的通路中，轴突导向通路，MAPK信号通路，前列腺癌通路，神经营养蛋白信号通路，结肠直肠癌通路等对于基因具有偏好性，并且在这些具有靶基因偏好性的通路中，合用与黄连素共同的靶基因、单用及合用共同的靶基因，对于通路的贡献率大，说明黄连素可能在两药协同作用中起着主要的作用。

2.4 KEGG 通路网络的分析

2.4.1 KEGG 通路的选取及基因整合 为从网络水平上分析两药协同作用的机制，从合用后影响的通路中，挑选出显著性强的5条通路。 并根据KEGG数据库中基因的整合信息，对靶基因进行整合，得到整合后的靶基因映射的通路网络。

2.4.2 KEGG通路网络的构建 在cytoscape软件中，分别将黄连素、吴茱萸碱单用对应的靶基因映射到合用后富集的5个通路网络中。重点分析网络中两类关键的靶基因：第一类靶基因是两药合用影响的特异靶基因，另一类靶基因是两药单用和合用共同影响的靶基因。调控两类靶基因的miRNA以及FC值，如Tab 2。

由Tab 2可以看出，两药合用后，调控特异靶基因的miRNA，FC值都小于0.5，表明miRNA被下调。由于miRNA表达的变化与基因表达的变化往往是相反的，因此对应的靶基因很可能被上调。而对于单用和合用共同影响的靶基因来说，黄连素主要使得这些靶基因表达下调。在miRNA水平上，有研究表明，hsa-miR-1207-5p和hsa-miR-188-5p在乳腺癌等癌细胞中表达上调，并可以通过此特征来判断是否患有乳腺癌[20]，而黄连素能够起到下调hsa-miR-1207-5p和hsa-miR-188-5p的作用，吴茱萸碱主要起到上调这些miRNA表达的作用。在靶基因水平上，有研究表明，在肝癌细胞系SMMC-7721中，AQP9的过表达，降低了PI3K的表达，从而抑制了肝细胞瘤的浸润、转移和体内异种移植肿瘤的生长[21]。吴茱萸碱主要影响这些靶基因低表达，而两药合用影响的miRNA主要诱导这些靶基因高表达，说明黄连素在两药合用时可能起到主要作用，而吴茱萸碱可能起到平衡黄连素的辅助作用。

Tab 2 The FC values of DEmiRNAS

两药合用后差异miRNA的靶基因富集的KEGG通路网络图，如Fig 5。从Fig 5联合用药差异miRNA的靶基因富集的通路可以得到，在癌细胞膜上，两药合用主要影响到4类膜受体，包括酪氨酸激酶受体：RTK；脑信号蛋白受体：PLEXINA、PLEXINB，主要参与信号转导、轴突引导、浸润性生长和细胞转移等；横跨模信号受体：SEMA4D，在细胞间的信号转导中起重要作用，指导中枢神经系统中轴突的生长；Wnt信号蛋白受体：FRIZZLED，具有G蛋白偶联受体和横跨膜信号受体的活性，与癌症通路相关。在癌细胞内部，两药合用主要明显影响到5条与癌症发生发展相关的信号通路，分别为Calcium signaling 通路、mTOR signaling通路、PI3K-AKT signaling通路、MAPK signaling通路、Wnt signaling通路。这些信号通路的扰动主要影响细胞的生长，扩增和分化等，进而引发癌症。

合用影响的靶基因还参与7个与癌症发生相关的生物学过程，分别为受体泛素化的降解、细胞周期的进程，肌动蛋白骨架的调控等。有文献证实，黄连素能够影响细胞周期，进而调控细胞的生长进程[22]。并且黄连素有使受体泛素化并降解的作用，在与其他药物产生协同抗癌作用时发挥重要作用[23]。有趣的是，两药合用时影响一种特殊的生物学过程：调控肌动蛋白细胞骨架(regulation of actin cytoskeleton)，有文献证实肌动蛋白的异常活动可以引发癌症[24]。合用影响的特异靶基因既分布于上游的细胞膜上，又参与到下游信号通路的转导，并且调控这些靶基因的miRNA都明显低表达。这与先前已知的很多抗癌药物都是根据膜受体设计的报道，具有一致性[25]。

黄连素和吴茱萸碱作用的蛋白靶点具有一定的重合。总体来说，黄连素作用的蛋白靶点比吴茱萸碱作用的靶点多，由Fig 5看出，在合用明显影响的5条通路中，有3条通路的下游是由黄连素影响的特异靶基因靶向的。在MAPK signaling 通路，Wnt signaling 通路中，上下游都是由联合用药来调控的，有可能改变了细胞骨架，调控了基因的转录水平，抑制了细胞的扩增，促进了细胞的分化。 黄连素和吴茱萸碱合用后，细胞膜上的4类膜受体，除了横跨膜信号受体SEMA4D没有靶向之外，其他3类膜受体都被靶向了，这说明协同作用的药物组合倾向于靶向更多种类的膜受体，可能会起到增强对信号通路下游的抑制，从而进一步放大药物协同作用的目的。

Fig 4 Enriched GO_BPs and KEGG pathways

In fig 4-1, the x axis stands for the enriched GO_BPs, the y axis stands for the-log(P); In fig 4-2, the x axis stands for the treatments, the y axis stands for the enriched KEGG pathways. The points stand for the numbers of the target genes. The larger is the point, the more target genes in the enriched pathways. The color stands for the-log(pvalue). The deeper of the color is, the more significant of the enrichments.A:Protein amio acid phosphorylation;B:Neuron differentiation;C:regulation of transcription;D:Ras protein signal transduction;E:regulation of kinase activity;F:vesicle-mediated transport;G:positive regulation of apoptosis…;H:response to organic substance;I:tube development and…;J:sensory organ development;K:urogenital system and kidney…;L:metabolic process.1:hsa05223:Non-small cell lung cancer;2:hsa05221:Acute myeloid leukemia;3:hsa05220:Chronic myeloid leukemia;4:hsa05215:Prostate cancer;5:hsa05214:Glioma;6:hsa05213:Endometrial cancer;7:hsa05212:Pancreatic cancer;8:hsa05210:Colorectal cancer;9:hsa05200:Pathways in cancer;10:hsa04930:TypeⅡ diabetes mellitus;11:hsa04916:Melanogenesis;12:hsa04910:Insulin signaling pathway;13:hsa04722:Neurotrophin signaling pathway;14:hsa04666:Fc gamma R-mediated phagocytosis;15:hsa04510:Focal adhesion;16:hsa04360:Axon guidance;17:hsa04310:Wnt signaling pathway;18:hsa04144:Endocytosis;19:hsa04012:ErbB signaling pathway;20:hsa04010:MAPK signaling pathway

Fig 5 The KEGG pathway network influenced by DEmiRNA of drug combinations

The color: red stands for the special target genes of drug combination; blue stands for non-target genes. The shape: diamond stands for the common targets under different treatments; hexagon stands for the common targets under two single drugs; rectangle stands for the common targets under berberine and combination; the circle stands for the special targets under combination; the triangl stands for the special targets under berberine.

由用药后，miRNA的调控水平来看，黄连素作用后，miRNA的表达都是下调，吴茱萸碱作用后，miRNA的表达主要是上调，但是两药合用后miRNA的表达都是下调，并不等于两药联合作用后miRNA的表达之和，有的甚至还会低于黄连素作用后miRNA的下调水平，原因可能是两药合用产生的协同效果，使得作用效果变强。

3 结论

本文从黄连素和吴茱萸碱单用及合用后影响的miRNA及对应的靶基因，结合生物学过程和KEGG通路，整合出药物影响的KEGG通路网络，从生物信息学角度系统地解析黄连素和吴茱萸碱协同作用的生物学机制。本文发现，黄连素和吴茱萸碱合用影响的特异靶基因既涵盖了通路上游细胞膜上的3类膜受体，又参与到下游信号通路的转导。通路上游全部由两药合用影响的特异靶基因靶向，并且合用使得调控这些靶基因的miRNA的表达都明显下调。单用和合用共同的靶基因中，黄连素和吴茱萸碱单用分别主要使得调控这些靶基因的miRNA的表达下调和上调，而合用使得调控这些靶基因的miRNA的表达下调，说明黄连素在两药合用中起到的干扰作用更大或更广泛，可能起到了主要作用。先前关于药物协同机制的研究大都基于基因及蛋白水平。黄连素和吴茱萸碱在miRNA水平上协同机制的发现，提示我们在今后挖掘药物协同机制时，不仅要从基因和蛋白水平，更要结合miRNA的调控水平等多维角度联合分析，为今后协同药物组合的发现提供了新的思路。

(致谢:本研究论文在同济大学生命科学与技术学院曹志伟教授课题组完成。感谢课题组老师和同学的尽心协助。)

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Study of synergistic mechanism in the combination of berberine and evodiamine from the perspective of miRNA

YIN Zuo-jing,CAO Zhi-wei,YAN Xin-miao,YANG Yi-yan,SHENG Zhen

(SchoolofLifeScienceandTechnology,TongjiUniversity,Shanghai200092,China)

Aim To explore the mechanisms of action (MOA) of synergistic anticancer function in the combination of berberine and evodiamine. Methods We first analyzed the action of suppression in the drug combination from the cell level and validated the dose scope as well as ratio of concentration in synergistic effects of drug combination. Then, the miRNA chip of liver cancer cell BEL-7402 under different treatment was analyzed. By building the miRNA-mRNA network, the MOA of the synergistic drug combination was illustrated. Results Berberine and evodiamine used in combination could significantly synergistically suppress the proliferative ability of liver cancer cells. The special differentially expressed miRNAs (DEmiRNAs) mainly participated in some cancer proliferation-related pathways and biological processes, such as MAPK signaling pathway, endocytosis pathway and insulin signaling pathway. The special target genes influenced by the drug combination not only covered three kinds of membrane receptors, but also took part in the regulation of downstream pathways. Conclusions From the regulation of miRNAs, it is clear that berberine may play a primary role in the synergistical suppression activity of the drug combination in cancer cells. The discovery of synergistic MOA in the combination of berberine and evodiamine from the miRNA level will provide a new guidance to explore more synergistic drug combinations in the future.

berberine; evodiamine; drug combination; synergistic drug combination; mechanisms of action; KEGG pathway; pathway network

时间：2017-5-25 17:44 网络出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170525.1744.016.html

2017-01-19,

2017-02-27

国家高等科技研究与发展基金(863项目)资助项目(No 2012AA020405)；卫生部资助基金项目(No 2012ZX10005001)

尹作静(1990-)，女，硕士生，研究方向：生物信息学，E-mail：bioyin@126.com; 盛 振(1988-)，男，博士，研究方向：生物信息学，通讯作者，E-mail：shengzhen@live.cn

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.06.008

A

1001-1978(2017)06-0772-09

R284.1；R329.24；R342.2；R735.705.31；R979.1