孙海烨张梁，2李由然顾正华丁重阳，2石贵阳，2

（1. 江南大学粮食发酵工艺与技术国家工程实验室，无锡 214122；2. 江南大学工业生物技术教育部重点实验室，无锡 214122）

利用增强型绿色荧光蛋白研究不同启动子在乳酸克鲁维酵母中的功能

孙海烨1张梁1，2李由然1顾正华1丁重阳1，2石贵阳1，2

（1. 江南大学粮食发酵工艺与技术国家工程实验室，无锡 214122；2. 江南大学工业生物技术教育部重点实验室，无锡 214122）

以增强型绿色荧光蛋白基因（egfp）为报告基因评价不同启动子在乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis）中的转录功能，寻找高效表达外源蛋白的启动子。以改造后载体pKLAC1*为基础，PCR克隆来源于K. lactis、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和Spathaspora passalidarum中7个不同的启动子，采用重叠延伸PCR分别与egfp融合后插入pKLAC1*，Bst XI线性化重组表达载体后电转化K. lactis GG799获得重组菌，利用特异性引物PCR扩增法快速筛选获得不同启动子调控下的单拷贝整合重组菌，通过定性和定量分析绿色荧光蛋白（EGFP）的表达，比较不同启动子的转录活性。荧光显微镜观察结果表明，K. lactis来源的pKladh4、pKlmal22，S. cerevisiae来源的pScgal7、pScgpd1，S. passalidarum来源的pSpmal1、pSpmal6、pSpgal1均成功调控EGFP的表达。荧光分光光度计定量测定结果表明，重组菌在pKladh4、pScgal7、pScgpd1调控下荧光强度分别为2.82、2.92和4.74，且在相应的诱导条件下转录能力分别提高了13%、57%和22%，均高于当前应用最广泛的强启动子pKllac4（荧光强度为2.13）。探究了不同来源启动子在K. lactis中的功能，pKladh4、pScgal7、pScgpd1具有高效起始转录能力，其中pScgpd1在K. lactis中的应用为首次报道。

乳酸克鲁维酵母；启动子；增强型绿色荧光蛋白；单拷贝整合；荧光强度

乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis）是美国FDA（Food and Drug Administration）认定为食品安全级（Generally regarded as safe，GRAS）的酵母菌，具有碳源利用范围广、生长速率快、能够分泌高分子量蛋白、不会对蛋白高度糖基化以及不产生内毒素等优势［1］。……