李凌凌 吕早生 左振宇 杨忠华 刘曜宁 宋采薇

（武汉科技大学化学与化工学院，武汉 430081）

酮还原酶中立体选择性还原位点的突变及其产物分析

李凌凌 吕早生 左振宇 杨忠华 刘曜宁 宋采薇

（武汉科技大学化学与化工学院，武汉 430081）

为验证糖多孢红霉菌聚酮合成酶中酮还原酶（EryKR）的LDD模式序列是否为控制2-甲基环己酮立体选择性还原的位点，构建了分别异源表达聚酮合成酶模块1的酮还原酶（EryKR1）、模块2的酮还原酶（EryKR2）、LDD残基替换为PQQ（LDD→PQQ）的EryKR1及PQQ替换为LDD（PQQ→LDD）的EryKR2的重组大肠杆菌Escherichia coli BL21（pET28a-eryKR1）、E.coli BL21（pET28a-eryKR2）、E.coli BL21（pET28a-TeryKR1）和E.coli BL21（pET28a-TeryKR2）。SDS-PAGE实验证明，经IPTG诱导后4个重组菌中都表达出相应的酮还原酶。粗酶液的比酶活分别为1.49 U/mg、0.37 U/mg、0.94 U/mg和0.31 U/mg。利用气相色谱分别检测4个重组菌还原2-甲基环己酮体系中产物的立体结构，结果显示与野生型EryKR1的还原产物以顺式-2-甲基环己醇为主不同，LDD→PQQ的突变型EryKR1催化2-甲基环己酮的还原产物主要为反式-2-甲基环己醇，而PQQ→LDD的突变型EryKR2的主要还原产物也由野生型EryKR2的反式-2-甲基环己醇转变成顺式-2-甲基环己醇，证实了LDD模式序列确实为酶中控制2-甲基环己酮立体选择性还原的位点。

聚酮合成酶；酮还原酶；2-甲基环己酮；突变；立体选择性

含有环己基的手性醇是很多医药、农药、有机化工产品及材料的重要中间体［1］，譬如，合成酸增殖剂的关键前体1-苯基-cis-1，2-环己二醇，合成手性药物的手性砌块光学纯的β-氨基环己醇等。利用基因工程技术构建不对称还原取代环己酮的生物催化剂，为合成这类手性醇提供了一种安全性、环境相容性、立体选择性均高的方法，但是，目前关于这方面的报道较少［2］。……