姬菩忠赵兴绪秦文宋学文张勇赵红斌

（1. 甘肃农业大学生命科学技术学院，兰州 730070；2. 兰州军区兰州总医院骨科研究所，兰州 730050）

大鼠NeuroD2基因的克隆、真核表达载体的构建及其在小鼠MSCs细胞中的表达

姬菩忠1，2赵兴绪1秦文2宋学文2张勇1赵红斌1，2

（1. 甘肃农业大学生命科学技术学院，兰州 730070；2. 兰州军区兰州总医院骨科研究所，兰州 730050）

克隆大鼠NeuroD2基因，旨在构建pIRES2-AcGFP1-ND2真核表达载体并检测其在小鼠MSCs中的表达。采用RTPCR技术克隆大鼠NeuroD2基因，分析该蛋白质结构、功能域、细胞定位及与其他物种同源性；构建pIRES2-AcGFP1-ND2表达载体并转染小鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）；采用Real-time PCR、免疫荧光及Western blot技术检测重组质粒在小鼠MSCs中的表达。结果表明，大鼠NeuroD2基因CDS区全长1 149 bp，共编码382个氨基酸，属于bHLH家族，二级结构以α-螺旋和无规卷曲为主，空间结构呈现近似“螺旋-环-螺旋（HLH）”结构，主要分布在细胞核，氨基酸序列与家鼠（99%）、罗猴（98%）、人（97.7%）同源性较高；Real-time PCR结果表明转染组NeuroD2基因表达量显著高于对照组（P＜0.05）；免疫荧光及Western blot结果显示转染组NeuroD2蛋白表达量显著高于对照组（P＜0.05）。成功克隆大鼠NeuroD2基因并构建了pIRES2-AcGFP1-ND2真核表达载体。

NeuroD2；基因克隆；生物信息学分析；pIRES2-AcGFP1-ND2

大鼠神经源性分化蛋白（Neurogenic differertiation，NeuroD）属于II类碱性螺旋-环-螺旋（Basic helix-loop-helix，bHLH）蛋白家族成员［1-3］，其基因位于2q32，是一种含bHLH结构域并结合E-box的转录因子，在神经分化过程中起重要作用［4］，其中NeuroD亚类（NeuroD，Nex-1［Math-2］，Math-3，and NeuroD2［NDRF］）大部分在神经发育过程中表达［5］。NeuroD2基因主要表达于大脑组织中，是控制神经分化的关键基因，其表达可从胚胎第11天开始持续到成年，Farah等［6］通过上调NeuroD2的表达使来源于小鼠胚胎的P19细胞获得神经元样形态并表达神经特异性蛋白β-tubulin III。……