周小桐 ， 初欢欢 ， 单 虎 ， 徐 燕 ， 于海龙 ， 王述柏

(1.青岛农业大学动物科技学院 ， 山东青岛266109 ； 2.青岛农业大学教务处，山东青岛266109；3.青岛奕奕和农牧科技有限公司， 山东青岛266109)

新城疫病毒分离株real-time RT-PCR检测与其遗传变异特性分析

周小桐1， 初欢欢1， 单 虎1， 徐 燕2， 于海龙3， 王述柏1

(1.青岛农业大学动物科技学院 ， 山东青岛266109 ； 2.青岛农业大学教务处，山东青岛266109；3.青岛奕奕和农牧科技有限公司， 山东青岛266109)

对肉鸡养殖场的疑似新城疫病例提取病毒核酸，采用便携式real-time RT-PCR仪T-COR4在2 h内检测到5株新城疫病毒，分别编号为RS1、RS2、HY3、LZ4、PL5。对确诊的阳性样品进行病毒增殖，血凝/血凝抑制试验，MDT、EID50、ICPI指数测定，F基因的遗传变异分析，结果显示，RS1、RS2、HY3株为新城疫基因Ⅶd型强毒株，LZ4、HY5株为新城疫基因Ⅱ型弱毒株。

新城疫病毒 ； 分离鉴定 ； F基因 ； 遗传变异 ； 毒力

新城疫(ND)是由新城疫病毒(NDV)引起的禽类急性、高度接触性传染病，严重危害养禽业发展，我国农业部将其列为一类动物疫病。近年来，随着ND全面防控免疫措施的深入，加之养禽业规模化集约化程度不断提高，ND的流行得到一定控制，整体呈下降趋势，但局部地区仍发生持续性地方流行，存在免疫失败和免疫带毒现象。对新城疫及时、快速、准确地检测对疾病的诊断和治疗具有重要意义。目前，NDV已有系统成熟的检测方法，但大多需在实验室标准条件下进行，检测过程较长。本研究旨在探讨NDV快速、实时的检测方法及发病地区NDV的遗传变异特性，从而为养禽场及时有效防控ND提供科学方法和理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.2 标准阳性血清 ND、禽流感(AI)(H5、H9)、产蛋下降综合征(EDS76)标准血清，购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所。

1.1.3 SPF鸡胚 购自山东省农业科学院家禽研究所，1 日龄雏鸡为SPF鸡胚于隔离器中自行孵化饲养。

1.1.4 主要仪器与试剂 便携式real-time RT-PCR仪T-COR4(Tetracore Inc.,Rockville,MD,USA)；MagMAXTM-96 Viral RNA Isolation Kit、AgPath-IDTMOne-Step RT-PCR Kit(LifeTechnologies, Carlsbad, CA, USA)。

1.2 方法

1.2.1 鸡群ND血清抗体水平的测定 鸡群随机抽检10份样品，翅静脉采血检测血清ND抗体水平[1]。

1.2.2 样品处理 采取疑似患鸡的肝和肺组织研磨至匀浆状态，加入适量PBS制成20%无菌滤液。

1.2.3 RT-PCR反应

1.2.3.1 引物设计与合成 参考GenBank发表的F基因序列，设计探针和特异性引物，扩增基因片段大小为363 bp。

表2列出了学生对学习效果、工作量和组内表现等各项的综合回答情况。t检验表明,探究式实验相对于传统实验提高了学习效果。此外,探究式实验的占分比例可合理地反映工作量,小组能很好地进行实验。对表1中问题Q3的回答表明,学生建议今后开展探究式实验的平均次数为1.2(95%置信区间1.1～1.3),这意味着在其后的每个年级应开设至少一次探究式实验。

1.2.3.2 病毒RNA的提取 按ABI Life Technologies MagMAXTM-96 Viral RNA Isolation Kit说明书，提取样品RNA。

1.2.3.3 一步法RT-PCR反应 运用便携式real-time PCR仪T-COR4进行PCR扩增。共25 μL反应体系：2×reaction Buffer，12.5 μL；混合引物(0.4 μmol/L)，1.5 μL；探针(0.132 μmol/L)，0.5 μL；1×Enzyme Mix，1.0 μL；RNA，3.0 μL；H2O，6.5 μL。

RT-PCR反应程序为：反转录45 ℃，10 min；DNA聚合酶反应(95 ℃，10 min；95 ℃，15 s；60 ℃，45 s)，共45个循环。1.2.4 病毒增殖 阳性病料滤液接种9～11 日龄 SPF鸡胚尿囊腔，每个样品接种5枚鸡胚，0.2 mL/枚，设置阴性对照接种生理盐水，37 ℃恒温孵箱孵育。观察鸡胚病变，无菌收集尿囊液，盲传3代[2]。

1.2.5 血凝试验(HA) 测定尿囊液的HA效价[1]。

EID50的对数=高于50%感染的病毒最高稀释度的对数+距离比×稀释系数的对数

1.2.9 接种致病指数(ICPI)测定 参考文献方法，测定病毒ICPI指数[4]。

1.2.10 PCR产物的克隆及序列测定分析 用DNAStar软件对PCR产物的克隆测序结果进行遗传进化分析[5]。

2 结果

2.1 发病地区新城疫流行特点及主要临床症状

自山东省肉鸡养殖场共收集疑似新城疫样品52份，检测到5株NDV，分别编号为RS1、RS2、HY3、LZ4、PL5。发病鸡群的血清抗体水平、主要临床症状和流行特点见表1。

表1 发病鸡群的血清抗体水平、主要临床症状和流行特点

2.2 RT-PCR反应 经real-time RT-PCR仪T-COR4扩增，Ct值在21.0时出现荧光增长曲线，为阳性反应(见中插彩版图1)。

2.3 病毒的分离鉴定 接种病毒的鸡胚多在48 h后死亡，死亡胚体全身出血，头部、颈部、肢端出血严重，收集的尿囊液清澈。盲传3代后检测HA效价均为28左右，HI检测5株分离株对NDV阳性血清呈阳性，对AI(H5、H9)和EDS76标准阳性血清呈阴性，确定分离株为NDV。

2.4 病毒致病指数测定结果 由表2可见，RS1、RS2、HY3三株的MDT值均低于60 h，ICPI值均大于1.5，根据标准判定为NDV强毒株。LZ4、PL5两株的MDT值在试验稀释倍数下未能测出结果，ICPI值小于0.5，判定为低等毒力毒株。

表2 病毒致病指数测定结果

2.5 NDV分离株F基因的分子特性分析

2.5.1 各毒株F基因的克隆测序及基因型分析 RS1、RS2、HY3三株分离株的蛋白裂解位点为112R-R-Q-K-R-F117，第101位氨基酸为K，第121位氨基酸为V，为基因Ⅶ型强毒株。LZ4、HY5分离株的蛋白裂解位点为112G-R-Q-G-R-L117，属于基因Ⅱ型弱毒株[4-5]。

2.5.2 F基因核苷酸及其编码氨基酸序列的同源性分析 RS1、RS2、HY3三株Ⅶ型NDV间同源性为98%以上，与国内外标准毒株的核苷酸同源性为83.2%～91.7%，与Ⅶ型标准株Taiwan95的核苷酸同源性约为91.0%。LZ4、PL5两株Ⅱ型NDV分离株间的核苷酸同源性为98.6%，与国内外标准毒株的核苷酸同源性为83.2%～99.7%，氨基酸同源性为89.3%～100.0%。与疫苗株LaSota、Clone30的核苷酸同源性约为99%。

2.5.3 F基因系统进化树的构建 分离株RS1、RS2、HY3与国内流行基因Ⅶd型毒株(KJ184581、EF57579733、JN618348)属同一分支。LZ4、PL5与标准株LaSota、Clone30处于同一分支，为基因Ⅱ型。

3 讨论

3.1 现场快速检测NDV方法的应用 ND作为禽类高发的急性烈性传染病，对NDV的高效快速检测对疾病的诊断具有重要意义。本研究应用的MagMAXTM-96 Viral RNA Isolation Kit采用磁珠净化技术，经现行国家兽医服务实验室(NVSL)评价能完美应用于NDV检测，克服了病毒滴度低、待处理样本量大且复杂、操作环境要求高的困难[6]。运用的AgPath-IDTMOne-Step RT-PCR Kit可一步性的进行反转录、PCR反应，该试剂可以完美适用于便携式real-time RT-PCR仪T-COR4，只需配备电池式便携离心机即可完成RT-PCR反应，可同时进行4个样品的检测。上述检测方法包括制备样品、提取病毒核酸、RT-PCR反应可在2 h内完成，能够完美适用于NDV的野外现场检测，检测结果直观有说服力，给NDV的快速鉴别诊断带来极大的便利。

图2 NDV F基因系统进化树注：方框内为试验分离株，其余均为参考株

3.2 ND的发病流行特点 ND作为养禽业高发的急性传染病，NDV一直处于不断进化中，给ND的防治带来了新的考验[7]。本研究检测的发病鸡群ND抗体水平均匀度不一，在4.4～6.0之间，有的鸡群达到5个滴度的跨度，调查发现该鸡场饲养管理粗放，生物安全措施不到位，不能做到免疫后的抗体监测，疫苗免疫质量低，增加了病原入侵的风险，导致NDV强毒感染。有的鸡群HI抗体效价达到6.0也能检测到NDV，这与宋敏训[8]的报道一致。田夫林[9]调查证实，高HI抗体并不能抵抗ND强毒入侵，抗体滴度为6作为NDV感染临界值的评估方法存在不足，HI抗体效价的高低不能完全代表鸡群的免疫状况。

流行毒株与免疫疫苗株的基因型差异，也是高免鸡群感染ND的原因。持续的ND监测发现，我国鸡群主要流行基因型为Ⅶ型，疫苗免疫中主要采用的不同毒力的弱毒疫苗和灭活疫苗，均为经典基因Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型[9]。流行株与疫苗株在抗原性上存在较大差异，常规疫苗不能对基因Ⅶ型等流行毒株提供良好的保护作用。2014年扬州大学利用反向遗传操作技术研制出与国内流行的基因Ⅶ型NDV抗原性和基因型匹配性良好的一类新兽药—重组ND灭活疫苗(A-Ⅶ株)，为我国ND的防控和养禽业的健康发展提供了坚实的保障[10]。

4 结论

山东省发病地区肉鸡ND的发生呈非典型症状、多种基因型并存、免疫带毒等特点。本研究通过现场制备检测样品、提取病毒核酸，经便携式real-time RT-PCR仪T-COR4检测分析，可在2 h内对ND进行确诊。共分离到5株NDV，其中3株(RS1、RS2、HY3)为基因Ⅶ型强毒株，与当前山东、江苏等地流行的Ⅶd型ND分离株属同一分支，两株(LZ4、HY5)属于基因Ⅱ型弱毒株，与标准疫苗株LaSota的亲缘关系较近。

[1] 于淼.山东鸡新城疫病毒分离鉴定与Ⅱ+Ⅶ基因型灭活疫苗研究[D].南京：南京农业大学, 2009.

[2] 郝东敏.山东地区Ⅰ群禽腺病毒的分离鉴定及多价油乳剂灭活疫苗的研制[D].泰安：山东农业大学,2014.

[3] 孙旭辉.我国新城疫分子流行病学及不同基因型灭活疫苗免疫保护力初步研究[D].南京：南京农业大学, 2006.

[4] 马由诏.长春地区新城疫病毒地方株的分离、鉴定及F基因的遗传进化分析，吉林农业大学， 2014.

[5] 程相朝.新城疫病毒地方株分子流行病学调查及其疫病控制，[D].南京：南京农业大学, 2003.

[6] LIu L, Benyeda Z, Zohari S,etal. Assessment of preparation of samples under the field conditions and a portable real-time RT-PCR assay for the rapid on-site detection of Newcastle disease virus[J].TransboundaryandEmergingDiseases, 2016(No.2): e245-e250.

[7] 刘建忠.鸡新城疫流行新特点及防治措施.中国畜牧兽医文摘[J]. 2016, 01: 160.

[8] 宋敏训,谭文君,王莉莉,等.鸡新城疫不同毒株间的交叉保护性研究.山东家禽,2001,04: 6-7.

[9] 孙旭辉.我国新城疫分子流行病学及不同基因型灭活疫苗免疫保护力初步研究[D].南京：南京农业大学, 2006.

[10] 刘秀梵,胡顺林,胡增垒,等.新城疫重组病毒灭活疫苗(A-VII株)的研制和临床试验.北京：中国畜牧兽医学会禽病学分会, 2012: 2.

Real-Time RT-PCR Assay for the Rapid On-Site Detection and Genetic Variation Characteristics Analysis of Newcastle Disease Virus

ZHOU Xiao-tong1， CHU Huan-huan1， SHAN Hu1， XU Yan2， YU Hai-long3， WANG Shu-bai1

(1.College of Animal Science and Technology, Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109， China；2.Teaching Administration Office of Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109， China；3.Qingdao Yiyihe Agro-pastoral Technology Co.,Ltd, Qingdao 266109， China)

Viral nucleic acids of suspected Newcastle disease virus(NDV) infection were extracted in broiler farms. 5 Newcastle disease virus (NDV) strains were detected with the real-time RT-PCR method in the portable T-COR4 platform within 2 h, named with RS1, RS2, HY3, LZ4 and PL5 respectively. Then the confirmed positive samples were detected with virus proliferation, HA/HI test, MDT, EID50, ICPI indexes determination, and F gene genetic variation analysis. The test results showed that RS1, RS2 and HY3 isolates were genotype Ⅶd velogenic NDV, and LZ4 and HY5 were genotype Ⅱ lentogenic NDV.

NDV ; separation identification ; F gene ; genetic variation ; virulence

WANG Shu-bai

2016-07-29

山东省自主创新及成果转化专项(2014ZZCX07105)；山东省现代农业产业技术体系家禽产业创新团队建设项目(SDAIT-11-14)

周小桐(1992-)，男，硕士生，主要从事动物营养与饲料科学研究， E-mail:895556858@qq.com

初欢欢(1991-)，女，硕士生，研究方向为预防兽医学，E-mail:15275210115@126.com

王述柏，E-mail：wshubai@163.com

S855.3

A

0529-6005(2017)05-0030-04

注：初欢欢与周小桐对本文具有同等贡献