张小露，高永峰

(1平顶山市第二人民医院，河南平顶山467002；2河南省眼科研究所 河南省立眼科医院)

增生型糖尿病视网膜病变患眼玻璃体、增生膜组织miR-195表达及意义

张小露1，高永峰2

(1平顶山市第二人民医院，河南平顶山467002；2河南省眼科研究所 河南省立眼科医院)

目的 探讨miR-195在增生型糖尿病视网膜病变(PDR)发生、发展中的作用及机制。方法 选取PDR患者56例(观察组)、特发性黄斑裂孔患者30例(对照组)，均为单侧发病。两组均接受常规玻璃体切割术，观察组术中采集玻璃体及视网膜前增生膜组织，对照组采集玻璃体及内界膜组织。采用实时荧光定量PCR法检测两组玻璃体和膜组织miR-195和高迁移率族蛋白B1(HMGB1)mRNA相对表达量，Western blotting法检测两组膜组织HMGB1蛋白相对表达量，并分析观察组玻璃体、膜组织中miR-195与HMGB1 mRNA相对表达量的关系。结果 观察组玻璃体及膜组织miR-195相对表达量均低于对照组，HMGB1 mRNA相对表达量均高于对照组(P均<0.01)。观察组膜组织HMGB1蛋白相对表达量为0.94±0.11，对照组为0.58±0.09，两组比较P<0.05。观察组玻璃体及膜组织中miR-195与HMGB1 mRNA相对表达量均呈负相关(r分别为-0.369、-0.508，P均<0.05)。结论 PDR患眼玻璃体及增生膜组织中miR-195表达均降低，其可能通过负性调控HMGB1表达而参与PDR的发生、发展。

增生型糖尿病视网膜病变；玻璃体；增生膜组织；微小RNA-195；高迁移率族蛋白B1

增生型糖尿病视网膜病变(PDR)是2型糖尿病患者常见的一种微血管并发症，是导致患者视力丧失甚至失明的重要原因[1]，目前其发病机制尚不完全清楚。微小RNA(microRNA，以下称miRNA)为广泛存在于生物体内的高度保守短小RNA，在细胞增殖、 分化、 凋亡、 免疫反应、肿瘤发生等多种生理、病理过程中发挥重要作用[2]。研究发现，某些miRNAs参与了糖尿病视网膜病变的发生与发展[3]，其中miR-195可通过抑制血管内皮生长因子(VEGF)表达而减少肿瘤组织中微血管的生成[4,5]。本研究观察了PDR患眼玻璃体及视网膜前增生膜组织中miR-195的表达变化，并探讨其在PDR发生、发展中的作用机制。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2015年5月～2016年5月于平顶山市第二人民医院眼科择期行玻璃体切割术的PDR患者56例(均为单侧发病，观察组)，男35例、女21例，年龄42～71(54.6±9.5)岁，糖尿病病程5～20(11.8±4.1)年；合并其他疾病情况：糖尿病肾病15例，大血管病变7例；根据中华医学会眼科学分会制定的分期标准[6]：Ⅴ期34眼、Ⅵ期22眼。纳入标准：①2型糖尿病所致PDR；②反复出现玻璃体积血，未经药物治疗或经药物治疗效果不佳，B超检查示视网膜前机化膜形成和(或)出现牵拉性视网膜脱离；③未出现明显玻璃体积血，但B超、检眼镜或光相干断层扫描检查示眼底出现增生膜和(或)出现牵拉性视网膜脱离。排除标准：①空腹血糖>8 mmol/L或合并严重高血压者；②有玻璃体视网膜或其他眼部手术史者；③接受抗新生血管药物治疗者；④其他因素所致视网膜增生、视网膜血管性疾病者；⑤合并恶性肿瘤、免疫系统疾病及急慢性感染者。同期选择择期行玻璃体切割术的特发性黄斑裂孔患者30例(均为单侧发病，对照组)，男16例、女14例，年龄40～72(55.6±9.8)岁，排除合并其他眼部疾病、恶性肿瘤、免疫系统疾病及急慢性感染者。两组性别、年龄具有可比性。本研究通过医院伦理委员会审核，患者均签署知情同意书。

1.2 玻璃体和膜组织miR-195、高迁移率族蛋白B1(HMGB1)mRNA表达检测 采用实时荧光定量PCR法。患者均接受常规玻璃体切割术，于灌注前使用玻璃体切割头，抽取玻璃体0.6 mL，置于微量离心管中；同时术中留取观察组视网膜前增生膜和对照组内界膜组织，-80 ℃保存备用。取两组玻璃体或膜组织，加入细胞裂解液进行裂解，TRIzol总RNA提取试剂盒提取细胞总RNA，紫外分光光度计检测纯度，以A260/A280≥1.80视为合格样品。采用逆转录试剂盒(德国Qiagen公司)将总RNA逆转录为cDNA，以cDNA为模板，采用PCR试剂盒(美国Invitmgen公司)进行PCR反应。miR-195、HMGB1及内参引物均由上海生工生物工程股份有限公司设计合成。miR-195引物：上游引物：5′-GCACGGTAGCAGCACAGAAA-3′，下游引物：5′-CACTTCCTCAGCACTTGTTGGTAT-3′，引物长度126 bp。 内参U6引物：上游引物：5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3′，下游引物：5′-GGAACGCTTCACGAATTTA-3′， 引物长度318 bp。HMGB1引物：上游引物：5′-GAGCATAAGAAGAAGCACCCAGAT-3′，下游引物：5′-GGGCGATACTCAGAGCAGAAG-3′，引物长度399 bp。内参β-actin引物：上游引物：5′-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3′，下游引物：5′-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3′，引物长度317 bp。PCR反应条件：94 ℃、1 min；92 ℃、30 s，58 ℃、30 s，75 ℃、30 s，共40个循环。每个样本设置3个平行反应复孔，采用2-ΔΔCt法计算两组玻璃体和膜组织miR-195、HMGB1 mRNA相对表达量。

1.3 膜组织HMGB1蛋白表达检测 采用Western blotting法。取两组患眼膜组织，研磨后加入细胞裂解液进行裂解，蛋白提取试剂盒提取总蛋白，采用BCA法对蛋白纯度进行检测。取20 μg蛋白样品，沸水中煮5 min使蛋白变性，进行SDS-PAGE凝胶电泳，电转移至PVDF膜。封闭液封闭过夜，加入一抗兔抗鼠HMGB1多克隆抗体(1∶2 000)，室温孵育120 min，TBST清洗3次；加入二抗室温孵育60 min，TBST清洗3次。采用ECL发光试剂盒发光显影，凝胶图像处理系统LabWork 4.0软件对条带灰度值进行分析。以目的蛋白条带灰度值与内参蛋白β-actin条带灰度值的比值计算HMGB1蛋白相对表达量。

2 结果

2.1 两组玻璃体miR-195、HMGB1 mRNA表达比较 观察组玻璃体miR-195相对表达量低于对照组，HMGB1 mRNA相对表达量高于对照组(P均<0.01)。见表1。

表1 两组玻璃体miR-195、HMGB1 mRNA相对表达量比较

注：与对照组比较，*P<0.01。

2.2 两组膜组织miR-195、HMGB1 mRNA表达比较 观察组膜组织miR-195相对表达量低于对照组，HMGB1 mRNA相对表达量高于对照组(P均<0.01)。见表2。

表2 两组膜组织miR-195、HMGB1 mRNA相对表达量比较

注：与对照组比较，*P<0.01。

2.3 两组膜组织HMGB1蛋白表达比较 观察组膜组织HMGB1蛋白相对表达量为0.94±0.11，对照组为0.58±0.09，两组比较P<0.05。

2.4 miR-195与HMGB1 mRNA表达的关系 观察组玻璃体和膜组织中miR-195与HMGB1 mRNA相对表达量均呈负相关(r分别为-0.369、-0.508，P均<0.05)。 3 讨论

PDR发生机制较为复杂，可能与体内炎症反应、自由基生成、糖基化终末产物堆积、二酰甘油-蛋白激酶C系统活化等多种病理过程有关[7,8]。糖尿病视网膜病变患者血清VEGF水平显著升高，且与病变严重程度有关[9]。而miR-195与肿瘤组织中微血管生成有关[10]，且可抑制VEGF表达[11]。因此，推测miR-195表达变化可能与糖尿病视网膜病变有关。本研究显示，观察组玻璃体及视网膜前膜组织miR-195相对表达量均明显低于对照组，说明PDR患眼玻璃体和视网膜前增生膜组织中miR-195表达降低，可能与PDR的发生有关。

HMGB1作为维持核小体结构及调节基因转录的非染色体核蛋白，是一种新型的促炎细胞因子，在多种炎症性疾病及自身免疫性疾病的发生中发挥重要作用[12]。研究发现，炎症反应在糖尿病视网膜病变微血管损伤中发挥重要作用，且参与糖尿病视网膜病变的发生及发展过程[13]；释放到细胞外的HMGB1可触发炎症反应，并诱导血管新生[14]；HMGB1可通过升高VEGF表达而促进缺血组织中的血管新生[15]。因此推测，HMGB1可能参与了PDR的炎症反应及血管生成。本研究观察组玻璃体及膜组织HMGB1 mRNA相对表达量均高于对照组，膜组织HMGB1蛋白相对表达量亦高于对照组，说明HMGB1表达降低与PDR的发生有关。有研究指出，HMGB1是miR-195潜在的靶基因[16]。本研究观察组玻璃体和膜组织中miR-195与HMGB1 mRNA相对表达量均呈负相关。由此推测，miR-195可能通过负性调控HMGB1的表达而促进炎症反应及血管生成，从而参与PDR的发生与发展。

综上所述，PDR患眼玻璃体和增生膜组织中miR-195表达降低，其可能通过负性调控HMGB1表达而参与PDR的发生、发展，但具体作用机制尚需进一步研究明确。

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2016-10-17)