谢承佳，庄琪

(扬州工业职业技术学院，江苏 扬州 225000)

酱油制曲研究进展

谢承佳，庄琪

(扬州工业职业技术学院，江苏 扬州 225000)

制曲是酱油生产中的关键步骤，对成品酱油的质量有重要影响。文章论述了酱油制曲的研究进展，包括制曲原料、菌种和工艺等，以期为实际工作提供参考。

酱油；添加剂；多菌种制曲；米曲霉

酱油是我国传统的酿造型调味品，因其味道鲜美、营养丰富广受大众喜爱。酱油酿造有一谚语：一曲、二醪、三熬油，说明制曲是酱油生产的关键步骤。所谓制曲，指的是菌种在适宜的条件下在曲料上扩大培养的过程，分为种曲制备和成曲制备。前者的目的是获得大量健康的孢子，后者是为了产生包括蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、果胶酶、脂肪酶等在内的丰富酶系，有利于在后续发酵过程中更加充分地进行生物转化。制曲是生产酱油的基础，对成品酱油的质量有重要影响。文章对酱油的制曲原料、菌种、工艺等进行了论述，以期为实际工作提供参考。

1 制曲原料

制曲的原料主要包括蛋白质原料、淀粉质原料和水。蛋白质原料的作用是提供微生物生长的氮源，常用的有大豆和豆粕。豆粕是大豆榨油的副产物，又分为低温豆粕和高温豆粕，后者由于价格便宜是最常用的酱油酿造原料[1]。淀粉质原料主要有面粉和麸皮，既提供碳源，又作为疏松剂，防止蒸料时夹心、制曲时通风不畅。近年来，一方面，由于豆类等蛋白质原料价格上涨，有必要寻找新的替代原料；另一方面，本着资源化利用各类废渣的原则，豆腐渣、大米渣、玉米蛋白粉、花生粕、菜籽粕、动物内脏、醋渣、酱油渣等各种副产物或下脚料也用于酱油的制曲及后续发酵过程[2-7]。

这些替代品大部分本身营养成分较为丰富，含有丰富的蛋白质、脂肪及多种微量元素，见表1。为了使原料中的有效成分能够充分释放并被利用，需用纤维素酶处理破坏细胞壁以利于发酵的进行[8]，或在高温下蒸煮以达到一定的消化率。以动物内脏作为制曲原料时，由于其本身蛋白质含量略低且动物组织中较高的蛋白酶活性，减弱了环境对米曲霉蛋白酶的诱导作用，成曲的蛋白酶活性水平可能较低。

表1 制曲原料成分分析 %

注：“*”代表此项指标在原文中未进行测定。

2 曲料添加剂

2.1 营养物

制曲原料中的碳源与氮源多为高分子结构，需酶解为单体后才能被微生物利用。因此，如果在原料中添加一些霉菌能够直接利用的营养物，对孢子的产生和菌丝的生长都很有利。倪海晴等[13]比较了不同的添加剂对成曲酶活和酱油质量的影响，在单因素实验中，葡萄糖作为外加碳源、NaNO3作为外加氮源对酶活的提高最显著，添加0.25%葡萄糖、0.1% NaNO3、0.05% ZnSO4时，成曲的蛋白酶活力和糖化酶活力比对照组分别提高了36.75%和46.02%；富含各种氨基酸、维生素及矿物质的酵母抽提物对种曲的培养也有显著的促进作用， 1.30%的添加量可使种曲孢子数提高54.88%，且更健壮[14]；梁姚顺发现酵母提取物对成曲酶活也有促进作用[15]。

2.2 无机盐及金属离子

无机盐本身为微生物生长过程所必需的。此外，酱油制曲过程中，一方面微生物需要产生酶分解消化营养物，进行自身生长；一方面酶活高低也是成曲的质量指标之一，而很多酶的活性中心都需要金属离子激活，因此在制曲过程中额外添加无机盐及金属离子对曲料质量有一定的促进作用。我国和日本很早就有文献报道锰离子和草木灰能够提高种曲质量。草木灰除了是很多酶的激活剂之外，还兼具调节细胞透性、提供营养等多种功能。鲁梅芳等[16]的研究表明：适量添加MnSO4、CaC12、KH2PO4能提高孢子出芽率，建议添加量分别为0.04%，0.4%，0.2%；武金霞等[17]在培养基中添加NH4NO3以提高种曲孢子数；此外，ZnSO4对成曲蛋白酶和糖化酶活力有促进作用，这可能与Zn2+对金属蛋白酶的激活作用以及参与DNA和RNA聚合酶的活动有关，SO42-本身对孢子生长也有促进作用[18]。

2.3 抑菌剂和防腐剂

制曲过程条件粗放，开放的状态会增加不良微生物的感染量，影响制曲效果。制曲过程中常见的杂菌包括细菌、酵母和霉菌，其中以细菌污染为最多。可在种曲制作时加入曲料量 0.3%的冰醋酸或0.5%～1.0%的醋酸钠形成酸性环境，抑制杂菌污染，促进孢子发芽[19,20]。顾立众等[21]将马齿苋、茵陈提取物和丙酸钠制成的复合制剂加入曲料中，在添加量很少的情况下就可以使细菌污染率降低92%，这主要与丙酸钠的抗菌作用有关。但实际应用时，要综合考虑丙酸钠对发酵菌种的影响。林彦彬的研究指出：抑菌剂对米曲霉的抑制作用可通过无机盐及金属离子的激活作用补偿，添加丙酸钙的情况下，添加0.05% MgSO4和0.025% ZnSO4有助于孢子萌发。

天然植物提取物也具有抑菌作用。见姬等[22]比较了24种植物提取液对2种耐盐酵母的影响，发现香叶、桂皮、小茴香、肉桂均具有较好的抑制作用，可用于酱油或蜜饯生产中防止腐败或表面产生白醭。此外，为了防止制曲过程中的青霉污染，也可将生物拮抗酵母拌入种曲制成曲，防止杂菌污染的同时还可提高酱油的质量[23]。

2.4 蛋白酶诱导剂

蛋白酶活力是成曲的重要质量指标，不少科研人员致力于此方面研究。宋小焱等[24]发现在不改变南方酱油制曲原料主要配方的情况下，单独添加1.5%芝麻饼或2%花生饼粉能使成曲蛋白酶活力分别提高51%或40%，原因可能在于米曲霉蛋白酶需外界诱导产生，但原料中的大豆源蛋白质对后续酶活提升作用较小，具体机理仍需进一步研究；武金霞等用米曲霉的激活性营养因子制成了激活剂，可提高种曲孢子发芽率及成曲酶活，提高原料利用率[25,26]。

3 制曲菌种和工艺

3.1 米曲霉制曲

我国酱油制曲中所用的微生物主要是米曲霉，制曲菌种的基本要求是不产真菌毒素；能产生活力较高的蛋白酶和淀粉酶；生长快、抗杂菌能力强；不产生异味等。米曲霉沪酿3.042是国内酱油厂家广泛使用的发酵菌种，具有生产周期短、抗性好、管理粗放等优点。为了获得更高的产量，不少学者对沪酿3.042的最佳产酶条件进行了研究。

李秀婷等[27]考察了沪酿3.042酶系的主要影响因素，研究发现：菌株固体发酵的最佳碳源为麸皮，氮源为蛋白胨，初始pH 6.0～8.0，温度30 ℃时，中性蛋白酶的产量最大。阚清华等[28]利用响应面分析法研究了沪酿3.042的产酶条件，最适条件为22 ℃培养，初始pH 7.0，料水比1∶0.8。

沪酿3.042的主要缺点在于酶系不全面，糖化酶和酸性蛋白酶低。不少研究者致力于寻找新的生产菌或改良沪酿3.042，旨在筛选出蛋白酶活力更高或更能适应高盐稀态酱油酿造中高盐分、低pH环境的菌株[29,30]。傅力等[31]通过紫外和LiCl复合诱变获得1株蛋白酶高产菌株，与出发菌相比，蛋白酶活力提高了33.3%且遗传稳定性良好。

3.2 混合菌种制曲

混合菌种制曲是指以米曲霉为主，添加其他菌种协同发酵制曲。混合菌种制曲的主要目的是提高原料利用率和酱油成品香气、色泽等质量标准[32]。与米曲霉混合发酵的菌株多具有如下特征：糖化酶和酸性蛋白酶活力较高，能与米曲霉酶系互补；能产大量纤维素酶，破坏原料的细胞壁，释放出其中的蛋白质与淀粉等原料；产酯化酶，丰富产品的香气；产红色素，增加酱油色泽。常用的混合制曲菌种包括：产生大量淀粉酶、酸性蛋白酶、纤维素酶、谷氨酰胺酶的黑曲霉；产纤维素酶、酯化酶的根霉和木霉；产糖化酶、酯化酶和红色素的红曲霉；产纤维素酶的粗壮脉纹胞菌等。混合制曲常用菌种及配比见表2。

表2 混合制曲菌种及配比

黑曲霉是较为常用的混合制曲菌种。杨钦阶等采用米曲霉和黑曲霉混合制大曲，盐水原料比为2∶1，45 ℃发酵120天后原料蛋白质利用率为86.28%，氨基酸转化率为55.64%，成品酱油感官评价好；程世杰等对米曲霉和黑曲霉混合制曲发酵中的氨基酸态氮与总氮进行了测定，发酵30天后全氮利用率和氨基酸态氮可达82.21%和1.162 g/dL，与单菌种相比分别提高了35%和7.8%；王亚威等采用双菌制曲，酱油的氨基酸态氮生成率提高了13.46%；米曲霉与黑曲霉、根霉、木霉、粗壮脉纹胞菌等复配多菌种制曲也均取得了较好的效果。

糖化增香曲是由烟灰红曲霉(Monascusruber)和紫红曲霉(Monascuspurpureus)菌株构成的复合曲种，具有较强的糖化力、酯化力和增色能力，在发酵过程中能形成多种酸、酯、醇、天然色素及生物活性物质，起到发酵增香的作用[43]。徐欢欢等[44]在高盐稀态酱油酿造中添加糖化增香曲与米曲霉混合制曲，氨基酸态氮含量、氨基酸生成率、全氮含量及还原糖含量分别提高了14%，9%，12%和5%；黄文彪等[45]添加糖化增香曲制曲，发酵90天后，高盐稀态酱油的还原糖和可溶性无盐固形物含量分别提高了47%和7%，但是糖化增香曲会影响中性和酸性蛋白酶活力；陈之瑶等[46]的研究也指出糖化增香曲对大曲蛋白酶的影响，如果以中性蛋白酶活力为指标，建议添加0.4‰的米曲霉和1.0‰的糖化增香曲，如果以酸性蛋白酶活力为指标，由于糖化增香曲对其有抑制，仅建议添加0.4‰的米曲霉。

混合菌种制曲中，由于多种菌种之间存在拮抗作用，需严格控制接种量和菌株配比。有研究发现采用双菌制曲时，米曲霉含量高于95%时会强烈抑制黑曲霉；戴德慧等[47]研究发现接种量对糖化酶和蛋白酶活力有很大影响。因此，为了获得更好的协同作用、减少竞争性抑制对各种酶活力的影响，多采用分开制种曲、混合制大曲或者分开制曲、混合发酵的工艺。也有研究采用激活性营养因子解决混菌发酵中多菌株生长不同步的问题。武金霞等用米曲霉的激活性营养因子制成了激活剂，可激发并加速米曲霉的萌发，在双菌种混合制曲时，使米曲霉和黑曲霉的孢子萌发率更为一致[48]。

混合菌种制曲的工艺参数要综合考虑多个菌种的最适产酶温度及协同作用，研究报道制曲温度多为30～36 ℃，制曲时间约为30～48 h，这与米曲霉所产中性蛋白酶和碱性蛋白酶的最适温度为32 ℃、米曲霉大部分酶的最高酶活出现在36～39 h的研究结果较为一致。

4 结论

目前，我国酱油生产主要采用高盐稀态和低盐固态发酵，但在制曲这一步上，工艺基本一致。除了本文中涉及的制曲原料、添加剂及制曲工艺外，制曲过程的具体条件控制，如品温、通风量、松曲时间、曲料厚度等均对成曲质量有重要影响[49,50]，在实际操作过程中需严格控制以获得高质量的产品。

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Research Progress of Koji Making for Fermented Soy Sauce

XIE Cheng-jia, ZHUANG Qi

(Yangzhou Polytechnic Institute, Yangzhou 225000, China)

Koji making is a key step in soy sauce production, which has an important influence on the quality of finished soy sauce. In this paper, the research progress of koji making is discussed, including the koji-making raw materials, strains and process, in order to provide references for the practical work.

soy sauce;additive;multi-strain koji making;Aspergillusoryzae

2017-01-19

谢承佳(1982-)，女，江苏南京人，讲师，硕士，主要从事生物化工教学方面的研究。

TS264.21

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.06.016

1000-9973(2017)06-0077-04