杜丽东，牛亭惠，吴国泰，王志旺，邵 晶，任 远

(甘肃中医药大学甘肃省中药药理与毒理学重点实验室，甘肃 兰州 730000)

·实验研究·

符合中医体征的血虚便秘小鼠模型的建立与评价*

杜丽东，牛亭惠，吴国泰，王志旺，邵 晶，任 远

(甘肃中医药大学甘肃省中药药理与毒理学重点实验室，甘肃 兰州 730000)

目的：建立血虚便秘小鼠模型，评价模型小鼠的体征并探讨模型复制条件。方法：将64只SPF级KM小鼠随机分为正常对照组、血虚组、便秘组和血虚便秘组，每组16只。血虚组皮下注射乙酰苯肼60 μg/g+腹腔注射环磷酰胺40 μg/g，便秘组灌胃复方地芬诺酯25 μg/g，血虚便秘组皮下注射乙酰苯肼60 μg/g +腹腔注射环磷酰胺40 μg/g+灌胃复方地芬诺酯25 μg/g，正常对照组皮下注射+腹腔注射+灌胃等量生理盐水，造模连续28 d。观察小鼠状态，检测体质量、血常规、粪便性状、小肠推进率(SIPR)、首粒黑便排出时间(TFBF)、粪便含水量(FWC)和结肠含水量(CWC)；结肠组织进行HE和AB-PAS染色，观察组织形态学改变。结果：与正常对照组对比，血虚组随造模时间延长，体质量增长缓慢，WBC、RBC、HGB和HCT均显著降低(P<0.05或P<0.01)，粪便质软、SIPR、TFBF、FWC和 CWC均无显著性变化(P>0.05)；便秘组体质量增长稍慢，WBC、RBC、HGB和HCT无显著变化(P>0.05)；血虚便秘组体质量增长缓慢，WBC、RBC、HGB和HCT均显著降低(P<0.05或P<0.01)；便秘组和血虚便秘组小鼠粪便质硬，SIPR显著减慢、TFBF显著延长、FWC和 CWC均显著下降(P<0.05或P<0.01)；血虚组小鼠结肠组织形态和黏液分泌与正常对照组相似(P>0.05)，便秘和血虚便秘组小鼠结肠黏膜层和大肠腺萎缩，黏液分泌减少(P<0.05)。结论：乙酰苯肼、环磷酰胺联合复方地芬诺酯能建立符合中医体征的血虚便秘小鼠模型，造模方法可控、简便、易行。

血虚便秘；小鼠；模型

便秘是一种临床常见症状，血虚便秘是中医临床常见的证型。患者多表现血虚阴亏、津枯血燥，面色萎黄或潮红，脉细数，舌质红而少津或淡而津干，大便量少、质干硬。便秘的产生原因有多种，或产后、术后失血过多，血虚肠燥；或热病后津液耗伤而致肠液干枯；或平素大便秘结，长期服用通便药导致肠液干枯；或老年人肠道功能减退、患有痔疾、妇女患月经病[1]。中医临床对血虚便秘的研究取得了长足进展，但血虚便秘动物模型的研究一直颇有争议，建立符合中医临床指征的动物模型是开展血虚便秘基础研究、开发有效治疗药物的基础。本研究采用复合因素建立血虚便秘小鼠模型，并与血虚和便秘模型小鼠进行对比，旨在建立一种简单易行、条件可控、基本能体现血虚便秘体征特点的小鼠模型，为相关科学研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 动 物

SPF级昆明种小鼠64只，雌雄各半，体质量18～22 g，由甘肃中医药大学实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK(甘)2015-0002。 饲养于甘肃中医药大学科研实验中心SPF级实验室。

1.2 药品与仪器

复方地芬诺酯片，常州康普药业有限公司产品，批号1603033；乙酰苯肼(APH), 上海源叶生物科技有限公司产品，批号20150701258；环磷酰胺(CPA)，山西普德药业股份有限公司产品，批号04150405。AU5400型全自动生化分析仪、BX51-32H01型显微镜，均为日本Olympus公司产品。

1.3 分组与模型的建立

参照文献[2-3]并在预实验基础上，将小鼠按性别、体质量随机分正常对照组、血虚组、便秘组和血虚便秘组，每组16只；自由进食饮水，适应性饲养1周。血虚组小鼠造模第1，4，7，10 天 皮下注射APH 60 μg/g，第10-14天腹腔注射CTX 40 μg/g；便秘组小鼠灌胃复方地芬诺酯混悬液25 μg/g( 5 d为1个疗程，疗程间停药2 d)；血虚便秘组小鼠造模第1，4，7，10天皮下注射 APH 60 μg/g，第10-14天腹腔注射 CTX 40 μg/g，同时灌胃复方地芬诺酯混悬液25 μg/g；正常对照组第1，4，7，10天皮下注射、第10-14天腹腔注射、同时灌胃等量生理盐水；各组给药容积10 μL/ g。造模连续28 d。

1.4 观测指标

1.4.1 一般状况与体质量

观察各组小鼠活动状态，毛色，口、鼻、唇、尾颜色，粪便形态。分别在造模前、造模第7，14，21，28天和造模结束第7天称量体质量。

1.4.2 血常规

分别在造模第28天和造模结束第7天，取各组小鼠8只，眼眶静脉丛取血20 μL ，采用全自动血液分析仪检测外周血中白细胞 (WBC) 计数、红细胞 (RBC) 计数、血红蛋白 (HGB) 含量和红细胞压积(HCT)。

1.4.3 首粒黑便排出时间(TFBF)和小肠推进率 (SIPR)

在造模第28天和造模结束第7天，禁食、不禁水12 h，分别取各组小鼠8只，每只灌胃50 g/L炭末糊0.5 mL，单笼饲养并记录各小鼠TFBF。造模第29天和造模结束后第8天禁食、不禁水12 h，取各组小鼠8只，每只灌胃50 g/L 炭末糊0.5 mL。25 min后颈椎脱臼处死，开腹，取出小肠，分离系膜，铺直，测量小肠全长(幽门至回盲部距离)及推进距离(幽门至炭末前沿的距离)，计算SIPR。 SIPR=推进距离/小肠全长×100%。

1.4.4 粪便含水量(FWC)和结肠含水量(CWC)

取1.4.3项处死小鼠，取结肠残留粪便，称湿重，80 ℃恒温干燥10 h，称干重，计算FWC。FWC=(湿重-干重)/湿重×100%。取结肠组织约 2 cm(距盲肠2 cm处)，称湿重，60 ℃恒温干燥6 h，称干重，计算CWC。CWC =(湿重-干重)/湿重×100%。

1.4.5 结肠组织形态

造模第29天，取结肠组织约1 cm(距离直肠2 cm处)， 40 g/L多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片，HE染色，光镜下观察。

1.4.6 结肠黏液分泌

造模第29天，取结肠组织约1 cm (距直肠 3 cm处)，卡诺氏固定液(无水乙醇︰冰醋酸︰氯仿=6∶1∶3) 固定，石蜡包埋，切片，AB-PAS染色，光镜下观察。

1.5 统计学方法

2 结 果

2.1 各组一般状况对比

正常对照组小鼠反应灵敏，皮毛密而有光泽，粪便形状规则，质稍软，互不粘连。血虚组小鼠蜷缩，萎靡，皮毛膨松、易掉，耳、鼻、唇、尾苍白，粪便较硬。便秘组小鼠皮毛光泽暗淡，排便减少，粪便干结、粘连。血虚便秘组小鼠蜷缩，萎靡，毛枯疏，光泽暗淡，耳、鼻、唇、尾苍白，排便减少，粪便干结、粘连。

2.2 各组小鼠体质量对比

造模前各组小鼠体质量对比，差别无统计学意义(P>0.05)。与正常对照组对比，随着造模时间延长，便秘组小鼠体质量增长虽减慢，但差别无统计学意义(P>0.05)；血虚组和血虚便秘组小鼠分别从造模第14 天、第7天起至造模结束第7天体质量增长显著减慢，差别有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。见表1。

组 别造模造模前造模第7天造模第14天造模第21天造模第28天造模结束第7天正常对照组18.8±1.321.4±1.522.5±1.524.1±1.525.2±1.925.7±1.5便秘组18.7±1.819.8±1.521.9±1.922.9±2.024.1±2.225.0±2.2血虚组19.1±2.119.9±2.120.5±2.0**22.3±2.122.6±2.0**23.0±1.9**血虚便秘组18.6±1.119.4±0.8*20.2±0.8**21.8±0.5**22.2±0.9**22.4±0.4**

注：与正常对照组对比，*P<0.05，**P<0.01。

2.3 各组小鼠WBC、HGB、RBC和HCT对比

与正常对照组对比，造模第28天和造模结束第7天，便秘组小鼠外周血WBC、RBC、HGB、HCT均无显著变化(P>0.05)；血虚组和血虚便秘组小鼠外周血WBC、RBC、HGB、HCT均降低，差别有统计学意义 (P<0.05或P<0.01)。见表2。

组 别造模第28天WBC/(×109个·L-1)HGB/(g·L-1)RBC/(×1012个·L-1)HCT/%正常对照组11.4±3.7146.8±22.58.6±1.434.4±7.4便秘组11.9±2.2150.2±22.08.7±1.334.7±8.4血虚组8.8±2.9*104.4±20.3**6.3±1.2**血虚便秘组6.5±2.6**102.5±15.0**6.1±1.2**26.5±7.3*

组 别造模结束第7天WBC/(×109个·L-1)HGB/(g·L-1)RBC/(×1012个·L-1)HCT/%正常对照组10.6±4.5151.7±10.57.9±0.832.2±2.5便秘组9.4±2.5135.5±27.07.4±1.329.7±4.7血虚组5.8±0.9*117.5±13.1*6.5±0.7*27.89±3.5*血虚便秘组5.5±1.4**116.0±24.6**6.3±1.3*25.7±4.4*

注：与正常对照组对比，*P<0.05，**P<0.01。

2.4 各组小鼠TFBF和SIPR对比

与正常对照组对比，造模第28天和造模结束第7天，便秘组和血虚便秘组小鼠TFBF延长、SIPR降低，差别有统计学意义(P<0.05); 血虚组小鼠TFBF有延长趋势、SIPR有减慢趋势，但差别无统计学意义(P>0.05)。见表3。

组 别造模第28天TFBF/minSIPR/%造模结束第7天TFBF/minSIPR/%正常对照组124.6±39.369.6±7.4113.3±30.070.1±7.7便秘组187.0±40.7**62.8±6.3*173.1±32.9**62.2±7.9*血虚组148.2±37.266.5±8.3139.3±42.769.1±6.1血虚便秘组184.9±26.2**61.8±8.4*186.8±47.1**61.7±7.4*

注：与正常对照组对比，*P<0.05，**P<0.01。

2.5 各组小鼠FWC和CWC对比

与正常对照组对比，便秘组和血虚便秘组小鼠FWC和CWC降低，差别有统计学意义(P<0.05或P<0.01)；血虚组小鼠FWC和CWC有降低趋势，但差别无统计学意义(P>0.05)。结果见表4。

组 别造模第28天FWC/%CWC/%造模结束第7天FWC/%CWC/%正常对照组64.6±8.078.1±3.869.4±5.776.8±7.0便秘组50.5±7.5**73.1±4.5*49.8±8.7**70.0±4.7*血虚组58.4±7.977.7±2.864.6±6.173.8±5.2血虚便秘组47.1±8.5**74.8±2.4*46.7±12.0**69.4±9.0*

注：与正常对照组对比，*P<0.05，**P<0.01。

2.6 各组小鼠结肠组织形态对比

正常小鼠结肠黏膜上皮层、固有层、黏膜肌层、黏膜下层、肌层、浆膜层均未见明显病理改变，结肠黏膜上皮完整，排列整齐。便秘组和血虚便秘组小鼠结肠黏膜层萎缩，黏膜固有层大肠腺明显萎缩，黏膜下层、肌层和浆膜层未见异常病理改变。血虚组各层未见明显异常病理改变。见图1。

图1 造模对小鼠结肠组织形态的影响(HE 染色，×10)

2.7 各组小鼠结肠黏液分泌对比

正常小鼠结肠黏膜层上皮细胞和杯状细胞形态饱满、圆润，黏液分泌丰富，黏膜表面覆盖混合性黏液。血虚组小鼠黏液分泌接近正常小鼠。便秘组和血虚便秘组小鼠黏膜层上皮细胞和杯状细胞出现不同程度萎缩，黏膜表面黏液覆盖减少。见图2。

图2 造模对小鼠结肠黏液分泌的影响(AB-PAS 染色，×20)

3 讨 论

目前，与病因病机相符合且能体现“证”的主要症状的血虚便秘模型的研究较少，且缺乏判断模型成功的金标准。文献报道的血虚便秘小鼠模型有皮下注射盐酸吗啡+剪尾放血[4]，灌胃盐酸洛哌丁胺+剪尾放血[5]，模型的判断标准为：动物出现血虚表现，如精神萎靡，蜷卧，少动，嗜睡，毛耸无华，眼睛淡白无神，鼻唇色淡，活动减少；血常规中WBC、RBC、HTC和PLT降低；出现粪便数量减少，便干，整肠传输时间延长等便秘症状。放血符合血虚便秘病因病机中“血的持久过度损耗，滋润和营养减弱”，但存在小鼠放血量难以精确控制、易致尾部血管变构、部分动物恢复过快而不出现血虚症状等缺点。本研究采用目前常用的化学因素APH和CPA致血虚方法联合止泻药复方地芬诺酯建立血虚便秘模型，并与血虚和便秘模型小鼠进行对比，旨在确立一种简便、可控的符合中医临床病证结合的血虚便秘小鼠模型。

本研究结果显示：与正常对照组对比，血虚组小鼠血虚但不便秘，随造模时间延长，体质量增长缓慢，血中WBC、RBC、HGB和HCT均显著降低，粪便质软，SIPR、TFBF、FWC和 CWC均无显著性变化(研究周期内，单种血虚未出现便秘症状，可能是由血虚导致便秘需要更长的时间)。便秘组小鼠便秘但血不虚：小鼠体质量增长正常，血中WBC、RBC、HGB和HCT无显著变化。血虚便秘组小鼠血虚兼便秘：小鼠体质量增长缓慢，血中WBC、RBC、HGB和HCT均显著降低。便秘组和血虚便秘组小鼠粪便质硬，TFBF显著延长，SIPR显著减慢，FWC和 CWC均显著下降，结肠黏膜层和大肠腺萎缩，黏液分泌减少。造模结束7 d，血液和便秘的相关检测显示与造模结束时一致，提示该模型比较稳定。以上结果与李国峰等[4-6]的研究结果一致。

本研究建立的血虚便秘小鼠模型操作简单，造模条件量化、可控、造模周期相对较短、模型基本稳定，但该模型属于血虚和便秘的兼证，未能体现血虚与便秘的因果关系。在目前没有更好的血虚便秘动物模型的情况下，可作为开展血虚便秘基础研究和开发有效治疗药物评价的动物模型。

[1]石鸣之.血虚肠燥便秘的临床治疗[J]. 江苏中医,1995,16(8):46.

[2]李伟霞,唐于平,段金廒，等.当归-川芎药对及其组成药味对3种血虚模型补血作用的比较研究[J]. 中国中药杂志,2011,36(13):1808-1814.

[3]谢培,周永学.大鼠功能性便秘模型建立方法的研究[J]. 陕西中医,2014,35(3):377-379.

[4]李国峰.养血活血方治疗血虚型便秘的临床研究及对便秘模型小鼠结肠ICC的影响[D].北京：中国中医科学院,2008.

[5] 刘五州,妥海燕,任远，等.当归对血虚便秘模型小鼠的治疗作用及机制研究[J]. 甘肃中医药大学学报,2016,33(2):1-4.

[6] 吴霜,程滢瑞,周锦勇，等.洛哌丁胺构建大鼠便秘模型对水通道蛋白AQP3和AQP8的影响[J].世界华人消化杂志,2014,22(7):969-974.

(编辑 陶 珠)

1001-6910(2017)03-0075-04

R256.35

B

10.3969/j.issn.1001-6910.2017.03.34

任远，教授，博士研究生导师，Leyuan816@163.com

甘肃省中药药理与毒理学重点实验室开放基金项目(ZDSYS-KJ-2015-009，ZDSYS-ZZ-2015-002，ZDSYS-KJ-2015-008)；陇原青年创新人才扶持计划项目(甘组电明字〔2015〕34号)；甘肃省中药现代制药工程研究院基金项目(YWW-2015050)

2016-12-09；

2017-02-20