蔡文杰，汤华成，温丹旭

（黑龙江八一农垦大学食品学院，大庆 163319）

阻断剂对三孢布拉霉菌产番茄红素的影响

蔡文杰，汤华成，温丹旭

（黑龙江八一农垦大学食品学院，大庆 163319）

为选取高效安全的阻断剂，本实验采用对比试验方法，首次选择茉莉茶茶渣、茶碱和烟酰胺三种阻断剂，研究其对三孢布拉霉（Blakeslea trispora）代谢合成番茄红素、β-胡萝卜素合成量和菌体生物量的影响，并进一步优化茶叶阻断剂促产番茄红素条件。研究结果表明：茶渣、茶碱、烟酰胺均可促进三孢布拉霉累积番茄红素。研究结果表明发酵40 h加入9 g·L-1茶碱、8 g·L-1茶叶、6 g·L-1烟酰胺时，番茄红素的合成量分别是36.32、158.38、34.69 mg·L-1，β-胡萝卜素的含量分别是33.25、42.07、31.79 mg·L-1，菌体生物量分别是24.69、38.53、27.40 mg·L-1。其中以茶渣阻断番茄红素环化成β-胡萝卜素效果最佳，对其进一步实验的茶渣最佳加入时间为48 h，最佳加入量为9 g·L-1时，番茄红素生物合成量可达到205.49 mg·L-1。研究结果为探索通过阻断番茄红素转化为胡萝卜素代谢路径提供了理论参考。

三孢布拉霉菌；阻断剂；番茄红素；茶渣

番茄红素具有清除自由基、预防多种癌症、保护心血管、抗老化、保护皮肤、增强免疫力等多种生理功能，已成为一种非常重要的类胡萝卜素并广泛应用[1]。已报道的番茄红素生产主要有微生物发酵法、化学合成法、天然植物提取法和基因工程法等，微生物发酵法由于其发酵周期短、可操作性强、成本低、副产物少等优点而被广泛认可，成为研究热点[2]。三孢布拉霉是目前可以实现工业化生产的唯一一种产番茄红素菌株，通过番茄红素环化酶抑制剂阻断番茄红素转化为β-胡萝卜素路径实现番茄红素的大量累积[3]。三孢布拉霉产番茄红素的途径是由八氢番茄红素经过脱氢反应生成的，有两种酶系参与完成脱氢反应。番茄红素经脱氢反应后，会在番茄红素环化酶的作用下发生环化反应，生成β-胡萝卜素。要想获得更高的番茄红素的生物合成量，就必须使番茄红素环化酶失去活行，阻断番茄红素环化成β-胡萝卜素，所以研究高效、低毒的阻断剂是至关重要的[4]。

这些抑制剂主要由两类物质组成，一类是叔胺类化合物，如三乙胺、3-二甲基-1-丙醇；另一类是含氮的杂环类化合物，比如吡啶、咪唑、哌啶及其衍生物均具有阻断番茄红素环化反应的作用[5]。为了提高三孢布拉霉菌发酵产番茄红素的含量，研究考察了茶叶、茶碱、烟酰胺三种物质，探究其对三孢布拉霉发酵的影响。在茶树体中，主要含有两大类生物碱：一类是嘌呤类生物碱，另一类是少量的嘧啶类生物碱。茶叶中已发现的嘌呤类生物碱有：腺嘌呤、乌嘌呤、黄嘌呤等，其特点均是以嘌呤环为基本骨架的含氮杂环类化合物[6]。少数的嘧碇类生物碱有：尿嘧啶、胸腺嘧啶和胞嘧啶。茶叶所包含的生物碱中，含量最多的是咖啡碱、可可碱、茶碱，这三种生物碱均属于含氮杂环类化合物[7]。烟酰胺的主要组成成分是3-吡啶甲酰胺，是一种含氮的六元杂环，属于吡啶类衍生物的一种。茉莉茶（茶叶及茶茎）、茶碱和烟酰胺等作为番茄红素环化酶抑制剂，为促进三孢布拉霉产番茄红素提供了原料和分子基础。

试验研究茶渣、茶碱、烟酰胺对于三孢布拉霉菌发酵生产番茄红素的影响，探索控制发酵过程中阻遏番茄红素环化反应进而提高番茄红素产量，可为番茄红素大量生产提供理论参考。

1 试剂、仪器和方法

1.1 主要试剂和材料

KH2PO4、MgSO4、VB1、氢氧化钠、石油醚、无水乙醇均为分析纯。番茄红素标准品购于阿拉丁试剂公司。生理盐水、茉莉茶均为市售。三孢布拉霉菌（产β-胡萝卜素，（+）菌）AF97006，三孢布拉霉菌（产β-胡萝卜素，（-）菌）AF96002，均购自于武汉大学菌种保藏中心。

1.2 主要仪器

恒温培养箱，上海市跃进医疗器械厂；立式高压蒸汽灭菌器，上海华线医用核子仪器有限公司；水浴恒温振荡器，太仓市强乐实验设备有限公司；真空干燥箱，郑州长城科工贸有限公司；722型紫外-可见分光光度计，上海精密仪器仪表有限公司；超净工作台，北京昌平长城空气净化设备工程公司；光学显微镜，南京麦迪森仪器有限公司；离心机，上海安亭科学仪器厂。

1.3 研究方法

1.3.1 培养基制备

活化培养基为PDA培养基，三孢布拉霉正、负菌分别接种至斜面培养基，28℃培养5 d。

种子培养基：玉米淀粉30 g·L-1，大豆粉（黄豆粉）50 g·L-1，KH2PO41.5 g·L-1，MgSO40.5 g·L-1，VB10.02 g·L-1，pH 6.5，121℃条件下灭菌20 min备用[8]。

发酵培养基：玉米淀粉50 g·L-1，大豆粉（黄豆粉）25 g·L-1，大豆油40 g·L-1，KH2PO41.5 g·L-1，Mg－SO40.5 g·L-1，VB10.02 g·L-1，pH 6.5（调到6.7，灭菌后会降0.2），121℃条件下灭菌20 min备用[8]。

1.3.2 培养条件

（1）种子培养：在无菌的操作条件下，将孢子悬浮液接种到种子培养基中，正负菌孢子接种量均1×105个·mL-1，接种量4%，250 mL锥形瓶中加50 mL培养基。200 r·min-1，25℃培养。种子培养采用非同步培养，负菌先进行种子培养，12 h后正菌进行种子培养，培养48 h。即负菌培养48 h，正菌培养36 h。

（2）发酵培养：发酵培养采用正负菌非同步混合发酵，即将生长旺盛的种龄48 h的负菌和36 h的正菌按照4∶1的比例进行发酵，即负菌接种量为8%（v/v）正菌接种量为2%（v/v），250 mL锥形瓶中加50 mL培养基，采用10 mL的一次性消毒注射器进行转移菌液。200 r·min-1，25℃培养120 h。以不加阻断剂的空白组为对照，茉莉茶茶叶研磨成茶渣后采取高温灭菌（121℃，20 min）后直接加入到培养基中，茶碱和烟酰胺溶于水后，使用微孔滤膜过滤后加入培养基中。

1.3.3 孢子悬浮液的制备

吸取已灭菌的生理盐水3 mL，反复抽吸冲洗试管斜面3 min，将菌液收集到离心管内，即制得未知浓度的孢子悬浮液。过滤后混匀孢子悬浮液，取样用血球计数板计数，控制孢子数106个·mL-1左右。

1.4 分析方法

1.4.1 菌体生物量的测量

发酵培养后的发酵液经3 500 r·min-1离心12 min，取清液，加入蒸馏水将离心管底部沉淀的菌体重新悬起来，再以3 500 r·min-1的速度离心12 min。重复上一步骤两次，离心后的菌丝体放在真空干燥箱内45℃条件下进行干燥3 h，恒重后称重。1.4.2番茄红素含量及β-胡萝卜素的测定

番茄红素标准曲线及β-胡萝卜素曲线的绘制：准确并避光称取番茄红素标准品（β-胡萝卜素标准品）100 mg，加入10 mL石油醚震荡、混匀并充分溶解，用石油醚定容至50 mL。定容后番茄红素（β-胡萝卜素）的浓度为2 mg·mL-1，分取此浓度番茄红素（β-胡萝卜素）标准液0.5、1、2、3、4、5 mL用石油醚稀释至5 mL，稀释后番茄红素（β-胡萝卜素）标准液最终浓度分别为：0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2 mg·mL-1。将稀释液分别在波长472（450）nm处测其吸光值，以番茄红素（β-胡萝卜素）标准液浓度作为横坐标，以吸光值作为纵坐标得出标准曲线的回归方程。

样品番茄红素（β-胡萝卜素）含量的计算公式如下：

式中：C—标准曲线获得或由回归方程算出样品

中溶液浓度，mg·mL-1；

D—萃取液的稀释倍数；

m—萃取所用的干菌体样品质量，g；

V—定容的石油醚体积，mL；

G—菌体生物量，g·L-1。

番茄红素（β-胡萝卜素）含量的测定方法：把真空干燥过的菌丝体用液氮进行研磨，研磨三次破壁后加入石油醚提取，抽提15 min至无色，将抽提的抽提液定容至5 mL（其颜色深浅程度与番茄红素或β-胡萝卜素的含量成正比关系），在472 nm（450 nm）处测量OD值，平行测定三次，分别用标准曲线及回归方程根据公式计算出番茄红素的浓度。

1.5 数据分析

数据分析使用SAS8.0软件进行分析。

2 结果与讨论

2.1 阻断剂不同添加量对发酵番茄红素的影响

研究表明，阻断剂的加入对菌体的生长有一定的毒害作用，过早加入阻断剂对菌体生理代谢有明显的毒害作用，不利于菌体生长，过晚加入阻断剂会使阻断效果会大大减弱[9]。所以本实验在发酵40 h分别加入茶渣、茶碱和烟酰胺，经预实验初步确定各种阻断剂的添加量，进行单因素实验，单因素实验阻断结果如下：

表1 不同阻断剂对番茄红素及β-胡萝卜素生物合成量的影响Table 1Effect of different blocking agents on the biosynthesis of lycopene and β-carotene

研究以茶渣、茶碱和烟酰胺作为三孢布拉霉发酵生产番茄红素的抑制剂，以不添加任何物质的组别作为空白对照，研究代谢过程中，抑制剂对环化反应的影响。于发酵40 h加入抑制剂，抑制结果如表1所示。实验表明茶叶、茶碱、烟酰胺都可以抑制番茄红素的环化反应，从而使番茄红素的生物合成量增加；β-胡萝卜的合成被部分阻断，使其生物合成量减少。

茶碱作为抑制剂，添加量为9 g·L-1时抑制效果最好。菌体生物量降为24.69 g·L-1（仅为对照组的77%），这是由于茶碱对菌体有毒害作用，使菌体少量死亡，番茄红素生物合成量最高可达到36.32 mg·L-1（合成量是对照组的4.5倍），β-胡萝卜生物合成量将为33.25 mg·L-1（合成量为对照组的30%）。茶渣作为抑制剂，添加量为8 g·L-1时抑制效果最好。菌体生物量增加到38.53 g·L-1（比对照组增加了21%），这是由于茶叶中含有多种碳水化合物、维生素、多元酚类可溶解于培养基中，促进菌体生长。番茄红素生物合成量最高可达到158.38 mg·L-1（合成量是对照组的16.7倍），β-胡萝卜生物合成量将为42.07 mg·L-1（合成量为对照组的38%），抑制效果最好。烟酰胺作为抑制剂对菌体也有一定的毒害作用，使菌体生物量不断下降。番茄红素生物合成量最高可达到34.69 mg·L-1（合成量是对照组的3.6倍），β-胡萝卜生物合成量将为31.79 mg·L-1（合成量为对照组的31%），抑制效果较好。茶叶的加入既使得菌体增加又能很好的阻断β-胡萝卜的合成。因此，研究将茉莉茶茶渣作为阻断剂考察不同添加时间和添加量对番茄红素生物合成量的影响。

2.2 茶渣作为阻断剂加入时间及加入量对发酵产番茄红素的影响

表2 不同加入时间及加入量对发酵产番茄红素的影响Table 2Effect of different adding time and dosage on lycopene production

对茶渣作为阻断剂的添加时间和添加量进一步进行探究，如表2所示。结果表明，随着添加时间从36 h增加到52 h，番茄红素生物合成量呈现先增加后减小的趋势。同时，随着添加量从6 g·L-1增加到10 g·L-1，番茄红素生物合成量也呈现先增加后减小的趋势。

过早的添加阻断剂或者加大添加量抑制β-胡萝卜素的合成，不仅抑制菌体的生长，而且也不有利于番茄红素的积累。因为三孢酸在发酵过程中，主要起到性激素的作用，可以大量促进类胡萝卜素的合成，β-胡萝卜素又是三孢酸的前体物质。因此过量的加入抑制剂会导致三孢酸的合成受阻，从而导致类胡萝卜素的产量下降。过晚的添加阻断剂或者添加量不足将会导致β-胡萝卜素大量积累，不能及时阻断番茄红素的环化反应使其产量降低[10]。因此，在发酵48 h时添加9 g·L-1的茶叶可以获得最佳的阻断效果，番茄红素的产量可达205.49 mg·L-1。修宇等[11]研究发现，以烟草作为抑制剂的样品番茄红素产量更可达170 mg·L-1，而且继续增加烟草添加量会降低各种类胡萝卜素的产量，直至菌体死亡。研究发现同样作为固形物加入培养架中的茶叶也能促进菌体生长，且对番茄红素环化酶环化作用的效果好于烟草。原因一是加入茶叶作为固形物在震荡培养时，可提高发酵过程培养基中氧的传递，增加锥形瓶中溶解氧浓度，使菌体生长更旺盛；原因二是茶叶中含有多种碳水化合物、维生素、多元酚类可溶解于培养基中，促进菌体生长[11]。

3 结论

实验结果显示，在发酵过程中添加各种含氮杂环的番茄红素环化酶抑制剂茶叶、茶碱、烟酰胺都可以抑制番茄红素的环化反应，均可促进三孢布拉霉累积番茄红素，其中茶叶效果更优。结果表明，在发酵48 h时添加9 g·L-1的茶叶，番茄红素的产量可达205.49 mg·L-1，不加任何阻断剂时番茄红素的产量可达9 mg·L-1，增幅达23倍。可见阻断剂在获得高产量番茄红素上有重要的作用，获得更高效、安全的抑制剂是三孢布拉霉发酵产番茄红素的研究重点。

［1］Agarwal S，Rao A V.Tomato lycopene and its role in human health and chronic diseases［J］.Canadian Medical Association Journal，2000，163（6）：739-744.

［2］杨建明，杨安全，许激扬.效应物促进红酵母累积番茄红素的工艺研究［J］.药物生物技术，2008（3）：204-207.

［3］姜丰，王颖，汤华成，等.三孢布拉霉菌发酵生产番茄红素的最佳条件的筛选［J］.黑龙江八一农垦大学学报，2013，25（2）：48-52.

［4］解书怀.三孢布拉霉发酵番茄红素工艺的研究［D］.无锡：江南大学，2008.

［5］姜飞，李翔国，刘海峰，等.乳酸菌复合系SFC-2增菌培养基的优化［J］.延边大学农学学报，2013（1）：11-17.

［6］谭和平，叶善蓉，邹燕，等.茶叶中生物碱的分析方法概述［J］.中国测试技术，2008（5）：5-9.

［7］李娟，活泼，杨海燕.茶叶功效成分研究进展［J］.浙江科技学院学报，2005（4）：285-289.

［8］Wang Qiang，Feng Ling-ran，Luo Wei，et al.Effect of inoculation process on lycopene production by blakeslea trispora in a stirred-tank reactor［J］.Applied Bioc Hemistry and Biotec Hnology，2015，175（2）：770-779.

［9］王常玲.产番茄红素菌株的选育及代谢调控的初步研究［D］.无锡：江南大学，2009.

［10］程娟，鹿保鑫，王霞，等.脂肪酶的固定化及其性能研究［J］.黑龙江八一农垦大学学报，2015，26（1）：45-50.

［11］修宇，袁其朋.烟草和MPTA对三孢布拉氏霉合成番茄红素的影响［J］.北京化工大学学报：自然科学版，2009 （1）：81-84.

Effect of Inhibitors on the Lycopene Production from Blakeslea trispora

Cai Wenjie，Tang Huacheng，Wen Danxu
（College of Food Science，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319）

In order to select the high efficient and safe blocking agent，comparative test method was used to study Blakeslea trispora metabolic synthesis of lycopene，beta-carotene and bacteria amount of biomass，choose the tea-leaf of jasmine tea，theophylline and nicotinamide as the inhibitors，and further the conditions that tea as a blocker produce lycopene were optimized.The results showed that：tea-leaf of jasmine tea，theophylline，nicotinamide could promote Blakeslea trispora to accumulates lycopene.After 40 h of fermentation adding 9 g·L-1theophylline，8 g·L-1tea-leaf of jasmine tea，6 g·L-1nicotinamide，lycopene synthesis were 36.32 mg·L-1，158.38 mg·L-1，34.69 mg·L-1，respectively.The beta carotene contents were 33.25 mg·L-1，42.07 mg·L-1，31.79 mg·L-1，Bacteria biomass was 24.69 mg·L-1，38.53 mg·L-1，27.40 mg·L-1.In which tea-leaf of jasmine tea was the best inhibitor，the further experiments showed that the best adding time was 48 h，optimum adding quantity was 9 g·L-1，lycopene biosynthesis could reach 205.49 mg·L-1.The research results provided a theoretical reference for the study of the metabolic pathway of the lycopene into carotene.

Blakeslea trispora，inhibitor；Lycopene；tea-leaf of jasmine tea

Q78

A

1002-2090（2017）03-0045-04

10.3969/j.issn.1002-2090.2017.03.010

2016-03-18

三孢布拉霉菌发酵生产番茄红素的最佳条件的筛选（GZ11B401）。

蔡文杰（1992-），女，黑龙江八一农垦大学食品学院2013级硕士研究生。

汤华成，男，副教授，硕士研究生导师，E-mail：byndthc@126.com。