曲博新，颜 玉，张瑞洲，张芮瑞，薛 琳，孙培茹

(1.佳木斯大学临床医学院，黑龙江 佳木斯 154003；2.佳木斯大学口腔医学院，黑龙江 佳木斯 154003)

金双歧对溃疡性结肠炎大鼠结肠组织细胞因子表达的影响①

曲博新1，颜 玉1，张瑞洲1，张芮瑞1，薛 琳2，孙培茹2

(1.佳木斯大学临床医学院，黑龙江 佳木斯 154003；2.佳木斯大学口腔医学院，黑龙江 佳木斯 154003)

目的：观察金双歧对溃疡性结肠炎大鼠结肠组织细胞因子表达情况。方法：将雄性Wistar大鼠30只随机分为5组：①对照组、②模型组、③惠迪组、④金双歧组、⑤惠迪和金双歧联合治疗组，每组6只。①对照组和②模型组：均灌肠生理盐水1mL·kg-1，③惠迪组：惠迪溶液2mL0.5g/kg·d灌胃1次。④金双歧组，金双歧溶液2mL7.5g/kg/d灌胃1次。⑤惠迪和金双歧联合治疗组：用莎尔福溶液2mL5g/kg·d和金双歧溶液2mL7.5g/kg·d灌胃1 次。给药第14天大鼠处死，剪下病变最明显结肠组织，吸干血迹称取15g加0.9%氯化钠研磨制浆，全自动脱帽离心机DD4-T3000r·min-1离心15min，取上清液-20℃保藏，IL-4，TNF-α运用RIA法测定。结果：惠迪、金双歧和惠迪和金双歧联合用药3个治疗溃疡性结肠炎大鼠TNF-α含量显著降低，而IL-4含量显著升高。结论：惠迪、金双歧对溃疡性结肠炎治疗均有效，联合用药效果更佳。

金双歧；溃疡性结肠炎大鼠；结肠组织；细胞因子；表达

1875年首先由Moxon和Willks描述溃疡性结肠炎(ulcerativecolitis，UC)，1903年Boas和Willks将其命名为溃疡性结肠炎，1973年世界卫生组织(WHO)医学科学国际组织委员会正式命名为慢性非特异性溃疡性结肠炎又称溃疡性结肠炎(ulcerativecolitis，UC)。溃疡性结肠炎病因目前尚未完全阐明，溃疡性结肠炎主要侵润结肠黏膜慢性非特异性炎性疾病，大多是开始于左半边结肠，然后向结肠近端乃至于全结肠连续不断逐渐进展[1]。溃疡性结肠炎结肠上皮产生抗原激活免疫淋巴细胞和巨噬细胞释放出多种细胞因子和血管活性物质，促进并加重结肠组织炎症反应，溃疡性结肠炎检测相关细胞因子水平和变化可作溃疡性结肠炎发生程度指标。本研究通过金双歧治疗溃疡性结肠炎大鼠模型检测结肠病理组织学及细胞因子变化，探索金双歧治疗溃疡性结肠炎依据，为临床探索辅助方法治疗溃疡性结肠炎。

1 材料与方法

1.1 动物及药物

雄性Wistar大鼠30只，体重(100±20)g，由佳木斯大学实验动物中心提供。金双歧(双歧杆菌乳杆菌三联活菌片)(内蒙古双奇药业股份有限公司)；惠迪(美沙拉秦肠溶片)(佳木斯鹿灵制药有限责任公司)。

1.2 主要试剂和仪器

2，4-二硝基氯苯(DNCB)(上海安诺芳胺化学品有限公司)，分析纯丙酮(山东禹王实业有限公司化工分公司)，无水乙醇(济南世纪通达化工有限公司)，36%醋酸(南京化学试剂股份有限公司)，0.9%氯化钠注射液(沈阳恒之盛商贸有限公司)，硫化钠(南阳同泰化工有限公司)。

免疫组化试剂盒(上海抚生实业有限公司)，Countstar自动细胞计数仪(上海睿钰生物科技有限公司)，全自动脱帽离心机DD4-T(长沙湘锐离心机有限公司)，BXP-124高档研究型双目生物显微镜(上海荼明光学仪器有限公司)。

1.3 2，4 二硝基氯苯(DNCB)+醋酸联合建溃疡性结肠炎大鼠造模及鉴定方法

1.3.1 造模方法。首先用100g/L硫化钠将雄性Wistar大鼠颈部背面毛脱去，去毛后颈部背面连续14d滴1次/d5滴(0.25mL)20g/L2，4-二硝基氯苯(DNCB)丙酮液，第15天用3mm直径导尿管经过肛门插入结肠8cm处，注入0.25mL0.1%DNCB乙醇溶液，第15天同部位注入2mL8%醋酸溶液，10s后用5mL0.9%氯化钠溶液冲洗。饲养14d每天连续观察大鼠大便性状、饮食、毛发和活动状态等[3]。

1.3.2 模型鉴定。溃疡性结肠炎大鼠造模30d后，采用病理学病理学检查可观察到结肠出现水肿、充血、炎细胞浸润、隐窝脓肿、杯状细胞减少、腺体破坏及小溃疡形成等一系列变化，可以确认溃疡性结肠炎大鼠造模成功[4]。

1.4 大鼠分组、给药及取材

将雄性Wistar大鼠30只随机分为5组：①对照组、②模型组、③惠迪组、④金双歧组、⑤惠迪和金双歧联合治疗组，每组6只。①对照组和②模型组：均灌肠生理盐水1mL·kg-1，③惠迪组：惠迪溶液2mL0.5g/kg·d灌胃1次。④金双歧组，金双歧溶液2mL7.5g/kg·d灌胃1次。⑤惠迪和金双歧联合治疗组：用莎尔福溶液2mL5g/kg·d和金双歧溶液2mL7.5g/kg·d灌胃1 次。给药第14天大鼠处死，剪下病变最明显结肠组织，吸干血迹称取15g加0.9%氯化钠研磨制浆，全自动脱帽离心机DD4-T3000r·min-1离心15min，取上清液-20℃保藏，IL-4，TNF-α运用RIA法测定[5]。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 金双歧等五处理大鼠一般状况表现

①对照组、②模型组、③惠迪组、④金双歧组、⑤惠迪和金双歧联合治疗组处理大鼠状况表现见表1。

表1 金双歧等五处理大鼠一般状况表现

2.2 金双歧等五处理大鼠结肠黏膜病理学检查2.2.1 结肠黏膜炎细胞浸润评分标准

溃疡性结肠炎大鼠结肠黏膜炎细胞浸润评分标准见表2。

2.2．2 结肠黏膜炎细胞浸润深度评分标准

溃疡性结肠炎大鼠结肠黏膜炎细胞浸润深度评分标准见表3。

表2 结肠黏膜炎细胞浸润评分标准

表3 结肠黏膜炎细胞浸润深度评分标准

2.2.3 金双歧等五处理对溃疡性结肠炎大鼠结肠黏膜损伤的影响

①对照组、②模型组、③惠迪组、④金双歧组、⑤惠迪和金双歧联合治疗组五处理对溃疡性结肠炎大鼠结肠黏膜损伤表现情况：①对照组大鼠在活动能力、饮食量、体重、排便均正常；②模型组大鼠精神萎靡、饮食量减少、体重下降，出现溏、血便，结肠组织出现炎细胞浸润深至全层，溃疡面比较大，深度达黏膜肌层；③惠迪组大鼠活动能力逐渐好转、饮食量渐增、体重稍有恢复、溏、血便稍有缓解，结肠组织炎细胞浸润缓解，溃疡稍小，深度没有达黏膜肌层；④金双歧组大鼠活动状况好转、饮食量增加、体重恢复、溏、血便改善，结肠组织炎细胞浸润明显缓解，溃疡小，深度达黏膜层；⑤惠迪和金双歧联合治疗组大鼠活动缓解、饮食量和体重正常、溏血便明显缓解，结肠组织溃疡和腺体增生基本愈合，但有明显愈合面存在。金双歧等五处理对溃疡性结肠炎大鼠结肠黏膜损伤的影响见表4。

表4 金双歧等五处理对溃疡性结肠炎大鼠结肠黏膜损伤影响±s，n=6)

注：与空白组比较，aP<0.01；与模型组比较，abP<0. 05，cP<0.01。

2.3金双歧等五处理大鼠血清IL-4与TNF-α水平变化

金双歧、对照、模型、莎尔福、莎尔福和金双歧联合用药处理大鼠结肠黏膜IL-4与TNF-α水平变化，见表5。

表5 金双歧等五处理大鼠结肠黏膜大鼠IL-4 及TNF-α水平变化

注：与对照组比较△P﹤0.05；与模型组比较☆P﹤0.05。

金双歧、对照、模型、莎尔福、莎尔福和金双歧联合用药处理大鼠结肠黏膜IL-4与TNF-α水平变化结果可以看出：①惠迪、金双歧和惠迪和金双歧联合用药3个治疗组IL-4、TNF-α表达均低于模型组，表现显著差异性(P<0.05)，说明金双歧、惠迪、惠迪和金双歧联合用药IL-4和TNF-α表达均有效降低。②惠迪组与金双歧组和金双歧和惠迪福联合用药组相比差异性显著(P<0.05)，与对照组相比表现差异不显著(P>0.05)，说明莎尔福和金双歧联合用药比单独用药治疗效果好。③莎尔福组与金双歧组相比IL-4和TNF-α表达表现不显著差异(P>0.05)，说明具有相当治疗效果。

3 讨论

慢性非特异性溃疡性结肠炎(ulcerativecolitis，UC)简称溃结，溃疡性结肠炎临床上分四种类型：①初发型：可转变为慢性复发型或慢性持续型；②慢性复发型：轻度充血、水肿，有典型的溃结病变；③慢性持续型：有轻重不等的腹泻、间断血便、腹痛及全身症状；④急性暴发型：起病急骤，全身及局部症状均严重，易发生中毒性结肠扩张，肠穿孔及腹膜炎。

慢性非特异性溃疡性结肠炎(ulcerativecolitis，UC)临床主要症状：①腹泻或便秘；②黏液脓血便；③里急后重；④腹痛；⑤全身表现；⑥肠外表现。溃疡性结肠炎具有急性暴发型病死率高；慢性持续型易反复发作癌变率高等特点。

慢性非特异性溃疡性结肠炎(ulcerativecolitis，UC)结肠炎基本病理变化：①结肠中各种炎性细胞浸润。②结肠中腺体萎缩、破坏、紊乱、基底膜断裂和消失。③结肠中隐窝脓肿及溃疡。④结肠黏膜下水肿及纤维化。⑤结肠黏膜杯状细胞减少或消失以至上皮再生。

慢性非特异性溃疡性结肠炎疾病病因多数学者认为与遗传因素、免疫功能障碍、感染及精神因素等有关。近年来，溃结成为消化系统疾病研究热点。刘丹等[13]金双歧联合柳氮磺胺吡啶治疗溃疡性结肠炎疗效满意，较单用柳氮磺胺吡啶好。宋清江等[14]金双歧片配合辨证口服中药治疗溃疡性结肠炎疗效优于单纯口服金双歧和单纯辨证口服中药，而复发率却低于单纯口服金双歧和单纯辨证口服中药。李慧等[14]治疗溃疡性结肠炎金双歧片与美沙拉秦片联合治疗可获得理想效果。

溃疡性结肠炎发病机制世界卫生组织目前普遍认可原因是由免疫反应介导引起，在遗传与环境及细菌协同作用下发生溃疡性结肠炎，然而肠道内细菌是溃疡性结肠炎发病引起的主要原因[11]。

IL-4主要由活化T细胞产生，IL-4对于B细胞、T细胞、肥大细胞、巨噬细胞和造细胞都有免疫调节作用。IL-4是T细胞自身分泌的生长因子，IL-4多数情况下对CTL和LAK细胞分化有正调节作用。IL-4多数报道认为溃疡性结肠炎中减少非常明显，临床研究表明溃疡性结肠炎患者IL-4基因表达同样减少。IL-4刺激T、B淋巴细胞增殖抑制细胞因子，由于抑制巨噬细胞和T淋巴细胞产生和移动就抑制促炎作用，IL-4肠道中抑制肠黏膜维持肠道免疫平衡起关键作用[12]。

实验研究发现溃疡性结肠炎大鼠TNF-α含量明显升高，而IL-4含量显著减少，表明大鼠肠道抗、抑炎因子平衡被破坏。经过惠迪、金双歧和惠迪和金双歧联合用药3个治疗溃疡性结肠炎大鼠TNF-α含量显著降低，而IL-4含量显著升高，表明惠迪、金双歧和惠迪和金双歧联合用药治疗溃疡性结肠炎机制之一可能是抑制促炎因子TNF-α表达，提高抗炎因子IL-4表达。调整抗、抑炎因子平衡关系，使肠道抗、抑炎因子平衡恢复，肠道黏膜组织修复溃疡得到良好治疗。

实验结果证实，应用惠迪、金双歧和惠迪和金双歧联合用药3个治疗溃疡性结肠炎大鼠TNF-α含量显著降低，而IL-4含量显著升高，可有效地改善大鼠一般状况，大鼠肠黏膜充血与水肿及溃疡明显减轻，大鼠腹泻症状明显改善，肠黏膜病理损害明显减轻，实验组与对照组相比表现显著差异性，说明惠迪、金双歧对溃疡性结肠炎治疗均有效，联合用药效果更佳。

[1]刘卓勋，颜玉.贝飞达联合美沙拉嗪对溃疡性结肠炎大鼠IL-10表达的影响[J]. 黑龙江医药科学，2012，35(1)：38-39

[2] 李楠，王雪明，翟俊山，等.复方血竭对溃疡性结肠炎大鼠模型结肠组织细胞因子的调节作用[J]. 中国实验方剂学杂志，2008，14(1)：53-54

[3]姚惠芬，陈务华，周毅.溃疡性结肠炎动物模型研究概况[J]. 天津药学，2006，18(4)：72-74

[4]NagasakiA，TakahashiH，IinumaM，etal．Ulcerativecolitiswithmultidrug-resistantPseudomonasaeruginosainfectionsuccessfullytreatedwithbifidbacterium[J]．Di-gestion，2010，81(3) :204-205

[5]AtreyaI，AtreyaR，NeurathMF．NF-kappaBinin-flammatoryboweldisease[J]．JInternMed，2008，263：591-596

[6]罗南，颜玉. 美沙拉嗪对大鼠溃疡性结肠炎NF-κB和TGF-β表达和影响[J]. 黑龙江医药科学，2010，33(4)：11-12

[7]RachmilewitzD，KatakuraK，KarmeliF，etal．Tolllikereceptor9signalingmediatestheanti-inflammatoryeffectsofprobioticsinmurineexperimentalcolitis[J]．Gastroenterology，2004，126(2) ：520-528

[8]靳大川，路德荣，张邦杰．金双歧联合氨基水杨酸制剂治疗溃疡性结肠炎疗效的Meta分析[J]．中华临床医师杂志，2016，10(3)：401-405

[9]孔丽霞，麦蕾，李啸峰．金双歧联合柳氮磺吡啶治疗溃疡性结肠炎疗效观察[J]．临床医药实践杂志，2008，17(6)：528-529

[10]ImaokaA，ShimaT，KatoK，etal．Anti-inflammatoryactivityofprobioticBifidobacterium:enhancementofIL-10productioninperipheralbloodmononuclearcellsfromulcerativecolitispatientsandinhibitionofIL-8secretioninHT-29cells[J]．WorldJGastroenterol，2008，14(16) : 2511-2516

[11]朱向东，曹燕飞，王燕，等．芍药苷对溃疡性结肠炎模型大鼠结肠组织病理形态及血清抗炎因子和促炎因子平衡的影响[J]．辽宁中医杂志，2013，40(9)：1927-1929

[12]刘丹，陈维顺，吴达军，等．金双歧联合柳氮磺胺吡啶治疗溃疡性结肠炎疗效观察[J]．中国医学工程，2006，14(5)：511-515

[13]宋清江，刘红燕，白晓莉．金双歧配合辨证口服中药治疗溃疡性结肠炎临床观察[J]．辽 宁中医药大学学报，2007，9(6)：151-152

[14]李慧．金双歧片与美沙拉秦片治疗溃疡性结肠炎临床分析[J]．大家健康，2014，8(24)：168

1.黑龙江省大学生创新创业训练计划项目，编号：201610222038；2.佳木斯大学大学生科技创新项目，编号：xsym2016-02；3.佳木斯大学科学技术研究项目，编号：Sjz2012-15；4.黑龙江省教育厅项目，编号：12511570。

曲博新(1995～)男，黑龙江佳木斯人，在读本科生。

颜玉(1963～)女，黑龙江佳木斯人，硕士，主任医师，教授，硕士研究生导师。E-mail:yanyu163.com。

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1008-0104(2017)02-0008-03

2016-11-02)