肖 敏, 屈小虎, 陈 慧, 蔡强军, 谢克俭

(温州医科大学检验医学院与生命科学学院， 浙江 温州 325035)

口服活性AdipoRon对2型糖尿病小鼠肝脏氧化应激的干预作用*

肖 敏, 屈小虎, 陈 慧, 蔡强军, 谢克俭△

(温州医科大学检验医学院与生命科学学院， 浙江 温州 325035)

目的：研究口服活性AdipoRon对2型糖尿病小鼠肝脏氧化应激是否有干预作用，为临床应用提供基础资料。方法：将健康雄性C57BL/6小鼠分为正常组(n=8)，糖尿病组(n=8)，AdipoRon高剂量治疗组(n=8)，AdipoRon低剂量治疗组(n=8)，以高脂饲料喂养6周后腹腔注射40 mg/kg链脲佐菌素(STZ)诱导2型糖尿病模型，用高、低剂量的口服活性AdipoRon分别对治疗组灌胃治疗10 d 后，检测相关生化指标，Western-blot法检测肝脏组织中IRS-1蛋白的表达；实时荧光定量PCR检测胰腺组织中PDX-1 mRNA 的表达。结果：DM组小鼠血糖值明显高于NC组(P<0.05)，DM+L组和DM+H组小鼠血糖值显著低于DM组。DM组小鼠肝脏组织中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性显著低于NC组(P<0.05)，丙二醛(MDA)及一氧化氮合酶(NOS)活性显著高于NC组(P<0.05)；DM+L组和DM+H组SOD、CAT活性明显高于DM组(P<0.05)，MDA及NOS活性显著低于DM组(P<0.05)。肝脏组织中IRS-1的蛋白表达及胰腺PDX-1 mRNA 表达显著升高，存在统计学意义(P<0.05)。结论：口服活性AdipoRon对糖尿病小鼠肝脏组织氧化应激有一定的干预作用，能降低小鼠的血糖水平。

AdipoRon；2型糖尿病小鼠；肝脏；氧化应激

【DOI】 10.12047/j.cjap.5451.2017.032

2型糖尿病是临床常见的因体内胰岛素分泌不足及或作用缺陷引起的慢性糖脂肪蛋白质代谢紊

乱综合征[1]。其主要特点是血葡萄糖水平的升高，长期代谢紊乱可引起多系统损害导致血管神经、肝脏和胰腺等组织器官的慢性进行性病变，胰岛素水平改变和胰岛素敏感性降低是糖尿病的两个重要标志。多年研究表明[2，3]，氧化应激是介导糖尿病发生发展的一个重要因素，同时也发现了一些药物可以通过减少氧化应激来治疗糖尿病。但如何对糖尿病患者组织氧化应激进行保护缺乏深入有意义的研究。AdipoRon 是近年来发现的由脂肪细胞分泌的一种特异性蛋白, 具有抗炎、抗糖尿病、抗动粥样硬化和增敏胰岛素的作用[4]。本实验以高脂饲料喂养联合STZ腹腔注射构建2型糖尿病动物模型，然后用高、低剂量的口服活性 AdipoRon进行灌胃，以探索口服活性AdipoRon是否对2型糖尿病小鼠肝组织氧化应激具有干预作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级雄性C57BL/6小鼠32只，称重18～22 g(由中国科学院上海实验动物中心提供)

1.2 主要仪器

博士医生TD-4252血糖测试仪(日本京都)，血糖仪专用试纸型号TD-4252 (日本京都)，全自动生化分析仪(日本日立公司)，紫外分光光度计(厂家)，ECTIPSE50I显微图像处理系统(Nikon)，KD-2508轮转式切片机(浙江省金华市科迪仪器设备有限公司)。

1.3 主要试剂

链脲佐菌素(STZ)(购于Sigma公司)，MDA、SOD、CAT 以及NOS测定试剂盒(南京建成生物工程研究所提供)，口服活性AdipoRon(购于上海恩美生物科技有限公司)，高糖高脂饲料(蛋白质19.2/20脂肪4.30/10碳水化合物67.3/70微量元素9.20/0)。 STZ配制液需先配制柠檬酸缓冲液。柠檬酸(FW：210.14)2.1 g加入去高压水100 ml中配成A液。柠檬酸钠(FW：294.10)2.94 g加入双蒸水100 ml中配成B液。用时将A、B液按一定比例混合(按1：1的)，pH计测定pH值，调节pH范围为4.2～4.5。

1.4 2型糖尿病小鼠模型的构建

将32只健康雄性C57BL/6小鼠随机分成正常组(NC组)和糖尿病组(DM组)，NC组喂食普通饲料(8只)；DM组喂食高脂饲料(24只)6周，禁食12 h后，按体质量腹腔注射链脲佐菌素(STZ)，注射剂量为40 mg/kg，连续注射2 d，72 h后禁食6 h测量血糖，断尾取血测空腹血糖浓度，血糖浓度>11 mmol/L的小鼠为2型糖尿病构建成功的模型。

1.5 2型糖尿病小鼠分组及给药情况

将DM组小鼠随机分为3组，每组8只：2型糖尿病模型对照组 (DM组)、低剂量AdipoRon治疗组(DM+L组)、高剂量AdipoRon治疗组(DM+H组)。按照体质量灌胃治疗，低剂量治疗组每天灌胃剂量为20 mg/kg，高剂量治疗组每天灌胃剂量为50 mg/kg，DM组给予等量的生理盐水，连续灌胃10 d。

1.6 观察指标及测定方法

颈椎脱臼法处死小鼠后，解剖取肝脏称重，清洗血液置于冻存管中液氮速冻后保存于-80℃冰箱。实验时，剪取适量肝组织，加入预冷生理盐水，在冰浴条件下，制成 10%的组织匀浆，低温600×g离心，取上清液，采用羟胺法测定SOD 含量、采用紫外分光光度法测定CAT含量、采用可见光分光光度法测定NOS含量、采用硫代巴比妥酸缩合法(TBA)测定MDA含量。

1.7 组织学检查

解剖时，每只小鼠取部分新鲜肝脏组织，4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，5 μm切片，苏木精-伊红(HE)染色。每个标本制作2张切片，每张切片随机取4个视野(×400)，用ECTIPSE 50I显微图像处理系统观察并采集图像，比较各组肝脏组织学形态变化。

1.8 肝脏组织p-IRS-1蛋白和胰腺组织PDX-1 mRNA表达检测

分别取肝脏和胰腺的部分组织，参照说明书步骤，采用Western-blot法检测肝脏组织中p-IRS-1蛋白表达变化，实时荧光定量PCR法检测胰腺组织PDX-1 mRNA的表达水平变化。

1.9 统计学处理

2 结果

2.1 口服活性AdipoRon对动物一般情况及血糖水平的影响

研究结果表明，注射STZ后，成模动物整体表现为进食、饮水、尿量明显增加，活动减少，皮毛光泽差。口服活性AdipoRon干预后动物进食、饮水、尿量均减少，体质量有所增加，活动增多，皮毛光泽渐好。

喂养初期各组小鼠体质量无显著差异(P>0.05)，实验末期DM组小鼠体质量显著低于正常对照组(P<0.05)。实验末期，DM组小鼠血糖浓度显著高于NC组 (P<0.01)，DM+L组和DM+H组显著低于DM组(P<0.05，表1)。

2.2 口服活性AdipoRon对2型糖尿病小鼠肝脏氧化应激的干预作用

结果表明，DM组小鼠肝脏组织中SOD、CAT活性显著低于NC组(P<0.01)，MDA及 NOS活性显著高于NC组(P<0.05)；DM+L组和DM+H组SOD、CAT活性显著高于DM组(P<0.05)，MDA及 NOS 活性显著低于DM组(P<0.05，表2)。

Tab. 1 Comparision of biochemical indices among four ±s, n=8)

NC: Normal control; DM: Diabetes model; DM+L: Diabetes model with low AdipoRon; DM+H: Diabetes model with high AdipoRon

*P<0.05vsDM group

Tab. 2 Comparision of biochemical indices among four ±s, n=8)

MDA: Malondialdehyde; SOD: Superoxide dismutase; CAT: Catalase; NOS: Nitric oxide synthase

*P<0.05vsDM group

2.3 口服活性AdipoRon对2型糖尿病小鼠肝组织形态学的影响

结果表明，NC组小鼠肝小叶结构清晰，肝细胞索排列整齐，肝窦规则，肝细胞无糖原积蓄，无空泡变性。DM组小鼠肝小叶结构紊乱，肝细胞的胞浆内可见大量小空泡，有的肝细胞内见多个小空泡融合成大空泡，空泡变性，肝细胞核被挤于一边，有大量脂肪变性，肝血窦变窄。DM+L组小鼠部分肝小叶细胞水肿，空泡变性，轻度脂肪变性。DM+H组小鼠肝小叶结构较清晰，肝细胞胞浆内空泡明显减少，仅肝小叶周边少数肝细胞呈脂肪变性改变。只有个别细胞水肿，空泡变性(图1)。

Fig. 1 Comparison of hematoxylin-eosin (HE) staining on kidney tissue among four groups (400×) A: NC group; B: DM group; C: DM+L group; D: DM+H group; NC: Normal control; DM: Diabetes model; DM+L: Diabetes model with low AdipoRon; DM+H: Diabetes model with high AdipoRon

2.4 口服活性AdipoRon对2型糖尿病小鼠肝脏组织中p-IRS-1蛋白表达水平的影响

与NC组(1.196±0.025)比较，DM组(0.632±0.005)、DM+H组(0.827±0.0076)、DM+L组(0.776±0.01)小鼠肝脏组织中p-IRS-1的蛋白表达水平有所降低(P<0.05)；与DM组比较，DM+H组小鼠肝脏组织中p-IRS-1的蛋白表达水平显著升高(P<0.05, 图2)。

2.5 口服活性AdipoRon对2型糖尿病小鼠胰腺组织中PDX-1mRNA 表达水平影响

与NC组比较，DM组、DM+H组、DM+L组小鼠胰腺PDX-1 mRNA表达水平有所降低(P<0.05)；与DM组比较，DM+H组、DM+L组小鼠胰腺PDX-1 mRNA 表达水平显著升高(P<0.05, 图3)。

3 讨论

AdipoRon[5]是近年发现的由脂肪细胞分泌的一种特异性蛋白，东京大学药物研究所的教授等对大量能够结合并激动脂联素受体的小分子化合物进行了筛选，他们根据这些小分子化合物是否具有激活AMPK的能力，选择出与脂联素作用相似的小分子化合物，并将其中一种命名为AdipoRon，能减轻高脂饮食小鼠和遗传肥胖小鼠的胰岛素抗性，以及葡萄糖耐受不良。AdipoRon还能延长高脂饮食db/db小鼠被缩短的寿命[6]。

本实验采用链脲佐菌素(STZ)构建2型糖尿病模型，注射STZ后, 成模动物整体表现为进食、饮水、尿量明显增加，体质量减少，说明成功构建2型糖尿病模型。有文献报道：SOD，CAT 对机体的氧化与抗氧化平衡起着至关重要的作用，SOD,CAT能够反映机体的抗氧化水平；MDA,NOS是最常见的脂质过氧化产物，MDA,NOS 的含量可以衡量脂质过氧化的程度，间接地反映出细胞受损伤程度[7,8]。糖尿病组小鼠肝脏组织中SOD、CAT活性明显低于正常对照组，MDA及 NOS活性显著高于正常对照组；高剂量AdipoRon治疗组SOD、CAT活性明显高于糖尿病组，MDA及 NOS 活性显著低于糖尿病组，说明口服活性AdipoRon对糖尿病小鼠肝脏组织氧化应激有一定的保护作用。文献报道[9]，胰岛β细胞凋亡与胰岛素抵抗有密切关系，相比较于正常组，糖尿病模型组PDX -1是降低的，具有统计学意义，其原因可能为胰岛β细胞凋亡增多，分泌的胰岛素减少，从而出现胰岛素抵抗。而与糖尿病模型组小鼠相比，给药组小鼠PDX -1是上升的，具有统计学意义，说明胰岛β细胞凋亡数量减少，分泌的胰岛素增多，胰岛素情况得到改善。有研究报道：胰岛β细胞分泌胰岛素后，经血液循环到达外周靶细胞，与胰岛素受体结合，经磷酸化和去磷酸化，激活多种酶，然后活化p-IRS-1，完成下游信号蛋白的级联反应，促进GLUT4转位，调节机体内的葡萄糖代谢，从而改善胰岛素抵抗[10]。本实验通过对小鼠肝脏p-IRS-1的测定，发现高剂量组小鼠肝脏p-IRS-1表达较之DM组有了明显的上升，提示了AdipoRon可以通过提高p-IRS-1的表达而改善2型糖尿病的症状。研究报道[11]：氧化应激会导致胰岛素抵抗，本课题成功构建2型糖尿病模型后，通过给小鼠灌胃AdipoRon治疗后，能够增强机体的抗氧化能力，从而改善胰岛素抵抗。

综上所述，本研究表明，AdipoRon对2型糖尿病小鼠肝脏组织氧化应激有一定的干预作用，能够降低小鼠的血糖水平，这对其临床应用具有一定的指导意义。

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Intervention effects of oral active AdipoRon on liver oxidative stress in type 2 diabetic mice

XIAO Min， QU Xiao-hu， CHEN Hui， CAI Qiang-jun， XIE Ke-jian△

(Department of Biology, School of Laboratory Medicine and Life Science, Wenzhou Medical University, Wenzhou 325035, China)

Objective: To explore the intervention effects of oral active AdipoRon on liver oxidative stress in type 2 diabetic mice, which provides basic data for clinical application. Methods: Thirty-two healthy male C57BL/6 mice were divided into 4 groups:normal group (NC,n=8), diabetes mellitus group (DM,n=8), high dose AdipoRon treatment group (DM+H,n=8) and low dose AdipoRon treatment group (DM+L,n=8). Following six weeks high fat feed, mice of DM, DM+H and DM+L were intraperitoneally injected with 40 mg/kg streptozocin (STZ), leading to type 2 diabetes. Afterwards, DM+H group and DM+L group were continuously treated with high dose and low doses of oral AdipoRon respectively for 10 days, following which, related biochemical indicators were detected. Western blot method was used to detect the p-IRS-1 protein expression in liver tissue and RT- PCR method to detect PDX-1 mRNA expression in the pancreas. Results: The blood glucose of DM group was obviously higher than that of NC group (P<0.05). Compared to that of DM group, blood glucose of DM+H group as well as DM+L group was significantly lower. Activity of superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) in liver tissue of DM mice was significantly lower than that of NC group (P<0.05); activity of malondialdehyde (MDA) and nitric oxide synthase (NOS) in DM group significantly higher than that of NC group (P<0.05); activity of SOD and CAT in DM+L group and DM+H group obviously higher than DM group (P<0.05); activity of MDA and NOS in DM+L group and DM+H group significantly lower than DM group (P<0.05). And the p-IRS-1 protein expression in liver tissue and PDX-1 mRNA level in pancreas increased significantly (P<0.05). Conclusion: Oral active AdipoRon which reduced the blood glucose levels of mice had a certain intervention effect on liver tissue oxidative stress in type 2 diabetes mice.

AdipoRon; type 2 diabetes in mice; liver; oxidative stress

2015年度浙江省公益技术应用研究计划(实验动物)项目 (2015C37099)

2016-05-03

2017-02-22

R587.1

A

1000-6834(2017)02-124-05

△【通讯作者】Tel： 13705883181； E-mail： xkj@wmu.edu.cn