蒋彪，王常高，杜馨，林建国，蔡俊*

（湖北工业大学发酵工程教育部重点试验室工业发酵湖北省协同创新中心，湖北武汉430068）

响应面法优化芽孢杆菌CJPE209产角蛋白酶发酵培养基的研究

蒋彪，王常高，杜馨，林建国，蔡俊*

（湖北工业大学发酵工程教育部重点试验室工业发酵湖北省协同创新中心，湖北武汉430068）

采用响应面法对芽孢杆菌（Bacillussp.）CJPE209产角蛋白酶的发酵培养基组分进行优化。在前期单因素优化的基础上利用Plackett-Burman试验设计筛选出影响产酶的2个显著性因素：羽毛粉、蔗糖。在此基础上，采用最陡爬坡试验确定中心复合试验的中心点，然后对其他不显著因素进行最低添加量试验以降低生产成本和简化培养基组分。利用中心复合试验，得到预测最佳培养基组成为羽毛粉5.6 g/L、蔗糖13.6 g/L、尿素5.0 g/L、KH2PO40.4 g/L、MgSO41.44 g/L、CaCl21.1 g/L、NaCl 5.0 g/L，预测角蛋白酶酶活为501.9 U/mL。用预测最佳培养基来进行发酵验证试验，结果实际角蛋白酶酶活为503.5 U/mL，表明模型能较好的预测发酵后酶活。

芽孢杆菌；角蛋白酶；响应面法；培养基优化

JIANG Biao,WANG Changgao,DU Xin,LIN Jianguo,CAI Jun* (Key Laboratory of Fermentation Engineering(Ministry of Education),Hubei Provincial Cooperative Innovation Center of Industrial Fermentation,Hubei University of Technology,Wuhan 430068,China)

角蛋白是一种不溶于水、盐、稀酸或稀碱，自然界中广泛存在的硬质蛋白，其蛋白结构中的多肽多由二硫键、氢键和疏水作用的其他化学键高度交联形成较为稳定的空间结构[1]。角蛋白主要来源于外胚层细胞，包括皮肤和皮肤的衍生物（如毛发、羽毛、鳞、甲、角质、喙等），分为α-角蛋白和β-角蛋白两种[2]。羽毛作为养殖产业的副产物年产量巨大，其中粗蛋白含量约占羽毛本身的85%以上，且蛋白多为角蛋白[3-5]。通过角蛋白酶降解羽毛得到小分子多肽和氨基酸，可以运用于饲料行业和医疗保健产品[6-7]。另外，角蛋白酶广泛应用于肥料、洗涤工业和皮革行业等领域[8-10]。

目前，在角蛋白酶的发酵研究中，主要集中在对发酵条件和发酵培养基这两个方面进行优化，研究方法上主要是用到单因素、正交和响应面试验对其进行优化[11]。由于单因素试验无法考虑到各因素之间的交互作用，正交试验无法获得全面可靠的水平组合，但响应面试验法不仅可以同时对影响生物量的各因素和各因素的相互作用进行比较和优化，还可以快速确定出各因素最优水平，减少试验次数，节约时间。RAMNANI P等[12]采用Plackett-Burman法选出影响地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）RG1产角蛋白酶的3个显著因素，并进一步通过中心复合试验得到最优产酶培养基，使优化后酶活提高3.5倍。THYS R C S等[13]采用响应面法对微杆菌（Microbacteriumsp.）kr10产角蛋白酶的发酵过程进行优化，最高酶活达到202.7 U/mL。ANBU P等[14]以Box-Behnken试验设计对Scopulariopsis brevicaulis产角蛋白酶培养基及条件进行优化，得到合适的产酶培养基组成及培养条件。

本研究以前期实验室筛选得到的一株芽孢杆菌（Bacillussp.）CJPE209作为出发菌株，在前期单因素优化的基础上，采用响应面法对其发酵培养基组分进行优化，提高酶活，为后期大规模生产提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌株

实验室自行筛选得到的一株芽孢杆菌（Bacillussp.）CJPE209：保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏编号为CCTCC M 2015734。

1.1.2 试剂

羽毛粉：市售；50 mg/mL水溶性角蛋白：东京化成工业株式会社；福林酚试剂（生物试剂）：国药集团化学试剂有限公司。

1.1.3 培养基

斜面培养基：蛋白胨10 g/L，牛肉膏5 g/L，NaCl 5 g/L，琼脂粉20 g/L；

种子培养基：蛋白胨10 g/L，牛肉膏5 g/L，NaCl 5 g/L；

初始发酵培养基：羽毛粉10g/L，尿素5g/L，蔗糖10g/L，KH2PO40.5 g/L，K2HPO4·3H2O 1 g/L，CaCl20.55 g/L，MgSO41.8 g/L，NaCl 5 g/L。

1.2 仪器与设备

SYNERGY2酶标仪：Gene Company Limited；3K15冷冻离心机：德国Sigma公司；TGL-16C台式离心机：上海安亭科学仪器制品厂；SW-CJ-1D型单人净化工作台：苏州净化设备有限公司；ZHWY-2102C恒温培养箱振荡器：上海智城分析仪器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 角蛋白酶粗酶液的制备

将保藏的菌种接种到斜面培养基37℃培养24 h以活化菌种。将活化好的菌种接种到种子培养基中37℃摇床振荡培养14 h，待菌株生长达到最大速度。取2%（V/V）种子培养液接种于25 mL发酵培养基，摇床220 r/min振荡培养48 h，取发酵液高速离心，得到上清液即为粗酶液。

1.3.2 角蛋白酶酶活测定方法

以1%的水溶性角蛋白（用0.01 mol/L的Tris-HCl缓冲液（pH9）稀释）作为底物，参考YAMAMURA S等[15]的测定方法，向1mL底物中加入1mL的粗酶液，55℃水浴反应20min后，加入2 mL 0.4 mol/L的三氯乙酸终止反应，高速离心取1 mL上清液加入4 mL 0.4 mol/L的碳酸钠溶液和1 mL福林酚试剂均匀混合，于40℃水浴反应20 min，取反应液200 μL于96孔板用酶标仪在波长680 nm处检测吸光度值；对照组使用先加入三氯乙酸灭活的酶液。

角蛋白酶酶活定义：在上述反应体系中，吸光度值每增加0.01为一个酶活单位（U/mL）。酶活计算公式如下：

D=（A-B）×C×100

式中：A为试验组吸光度值；B为对照组吸光度值；C为粗酶液稀释倍数；D为角蛋白酶酶活，U/mL。

1.3.3 Plackett-Burman（PB）试验设计

本研究选取N=12的试验设计，选取前期单因素试验中对酶活影响较大的7个因素，每个因素分为高（+）、低（-）两水平，按照设计方案进行12次试验，以角蛋白酶酶活为响应值，挑选出置信度＞95%的因素作为影响酶活的显著因素。PB设计因素与水平见表1。

表1Plackett-Burman试验设计因素与水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman experiments design g/L

1.3.4 最陡爬坡试验

通过PB试验得到影响角蛋白酶酶活的显著因素，依据各因素的效应值来选择适当步长，通过最陡爬坡试验找到拐点，为下一步中心复合设计（central composite design，CCD）提供中心点数据。

1.3.5 最低添加量试验

经PB试验得到影响粗酶液酶活的显著因素和不显著因素。为了降低成本、简化培养基组分，选择不显著因素进行合理步长的单因素试验，确定不显著因素组分的最小添加量。1.3.6中心复合设计（CCD）试验

根据PB试验和最陡爬坡试验结果，通过2因素5水平的试验来确定芽孢杆菌CJPE209产角蛋白酶的最佳培养基组分。CCD利用13组试验，用软件对试验结果进行回归分析、方差分析和分析两因素之间的相互作用，同时通过对试验数据分析得到模型的多元函数和响应面三维立体图。然后用预测最佳培养基组分进行发酵验证试验。试验自变量水平的编码值和实际值见表2。

表2 中心组合设计试验因素与水平Table 2 Factors and levels of central composite design experiments

2 结果与分析

2.1 PB试验

PB试验结果如表3所示。对PB试验结果进行回归分析和方差分析，结果见表4和表5。

表3Plackett-Burman试验设计与结果Table 3 Design and results of Plackett-Burman experiments

表4Plackett-Burman试验设计回归分析Table 4 Regression analysis of the Plackett-Burman design

表5Plackett-Burman试验设计方差分析Table 5 Variance analysis of Plackett-Burman design

由表4可知，α=0.05时羽毛粉和蔗糖的P值在95%的置信区间内都＜0.05，表明羽毛粉和蔗糖都是影响CJPE209产角蛋白酶的显著因素。通过效应值知道蔗糖为正效应，羽毛粉为负效应。

由表5可知，此模型在95%的置信区间内显著，其决定系数R2=87.60%，说明回归方程能解释87.60%的试验数据，同时证明此模型合理。

2.2 最陡爬坡试验

根据PB试验得到的结果，按照各因素的效应值合理设计试验的变化步长和最陡爬坡试验，其步长及试验结果见表6。

表6 最陡爬坡试验设计与结果Table 6 Design and results of the steepest ascent tests

由表6可知，第1组到第3组角蛋白酶或逐渐升高，而从第4组酶活就开始下降，即第3组试验为最陡爬坡的拐点，因此选择第3组（蔗糖和羽毛粉的添加量分别为蔗糖12g/L、羽毛粉6 g/L）作为下一步中心复合试验的中心点。

2.3 最低添加量试验

由PB试验结果可知，所选取的7个因素中尿素、KH2PO4、K2HPO4·3H2O、CaCl2和MgSO4为不显著因素。将这5个因素做最低添加量试验，结果见图1。

由图1a可知，酶活随着尿素添加量的增加而升高，在尿素添加量为4 g/L时酶活达到最高为417 U/mL，当尿素添加量继续增加时粗酶液酶活开始下降，因此尿素的最佳添加量为4g/L；由图1b可知，当磷酸二氢钾的添加量从0～0.4g/L逐渐增加时，粗酶液酶活随磷酸二氢钾的添加量的增加而提高，但磷酸二氢钾的添加量继续增加时，粗酶液酶活变化很小，因此磷酸二氢钾的最佳添加量为0.4 g/L；由图1c可知，磷酸氢二钾的添加量从0～1 g/L逐渐增加时，粗酶液的酶活变化不大，为节约成本和简化培养基，故磷酸氢二钾选择不添加到培养基；由图1d可知，硫酸镁的添加量在0～1.44 g/L的范围内逐渐增加，粗酶液的酶活在硫酸镁添加量为1.44g/L达到最高为416g/L，因此硫酸镁的最佳添加量为1.44 g/L；由图1e可知，粗酶液的酶活随氯化钙的添加量的增加而增加，当氯化钙的添加量为1.1 g/L时，酶活达到最高为447U/mL。故选择尿素、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁和氯化钙的添加量分别为4 g/L、0.4 g/L、0 g/L、1.44g/L和1.1 g/L。

图1 最低添加量试验设计与结果Fig.1 Design and results of the minimum addition experiments

2.4 中心复合设计（CCD）试验

通过最陡爬坡试验得到两个影响酶活的显著因素（蔗糖和羽毛粉）的中心复合试验的中心点：蔗糖12 g/L、羽毛粉6 g/L。以这两种显著因素的浓度为自变量，角蛋白酶酶活为响应值，进行2因素5水平的中心复合设计试验，试验结果见表7。固定培养基其他组分为：尿素4 g/L、磷酸二氢钾0.4g/L、硫酸镁1.44g/L、氯化钙1.1 g/L和氯化钠5 g/L。

表7 中心复合试验设计与结果Table 7 Design and results of central composite design

表8 响应面二次模型方差分析Table 8 Variance analysis of response surface quadratic model

由表8可知，模型的P值远小于0.05，并且模型多元相关系数R2=99.41%，表明预测仅有0.59%的数据不能由该模型解释。失拟项P＞0.05，不显著，说明该模型无失拟现象。

通过Designexpert8.0.6对二次回归系数的分析和计算得到A蔗糖和B羽毛粉对角蛋白酶酶活力影响的模型方程：

Y=493.9+38.75A-2.85B+24.37AB-20.98A2-17.73B2

通过软件分析得到蔗糖和羽毛粉交互作用的三维立体图见图2。

图2 蔗糖和羽毛粉交互作用对角蛋白酶酶活影响的响应面和等高线Fig.2 Response surface plots and contour line of effects of interaction between sucrose and feather meal on keratinase activity

由图2可知，当羽毛粉添加量不变时，蔗糖添加量对酶活存在二次效应，曲面呈抛物面，此响应面图呈典型的钟罩状，说明蔗糖和羽毛粉的交互作用比较明显。根据上述分析及软件计算，预测最佳组合为：蔗糖13.6 g/L和羽毛粉5.6 g/L。最终预测的最佳培养基为：蔗糖13.6 g/L、羽毛粉5.6 g/L、尿素4 g/L、磷酸二氢钾0.4 g/L、硫酸镁1.44 g/L、氯化钙1.1g/L和氯化钠5g/L。预测最高酶活为501.9U/mL。

为验证模型预测的可靠性，在用预测得到的最佳培养基的条件下进行3次发酵试验，结果角蛋白酶酶活平均值为503.5 U/mL。预测值与实际值较吻合，说明该模型是比较合理的。

3 结论

本研究以试验室筛选、保存的一株芽孢杆菌（Bacillus sp.）CJPE209为出发菌株，采用响应面法对其发酵培养基进行优化，得到最终培养基：蔗糖13.6 g/L、羽毛粉5.6 g/L、尿素4 g/L、磷酸二氢钾0.4 g/L、硫酸镁1.44 g/L、氯化钙1.1 g/L和氯化钠5 g/L，此条件下角蛋白酶酶活为503.5 U/mL。通过验证试验确定其预测值和实际值较吻合，说明响应面法优化是合理的、可靠的。并且相较于响应面优化前的酶活417U/mL提高了20.74%。同时本研究对后期酶的规模生产提供参考和铺垫。

[1]周兴华，姜蕾，敖波，等.羽毛蛋白开发应用发展[J].中国饲料，2003（20）：28-29.

[2]王镜岩.生物化学.上册[M].北京：高等教育出版社，2002：221-222.

[3]ONIFADE A A,AL-SANE N A,AL-MUSALLAM A A,et al.A review: Potentials for biotechnological applications of keratin-degrading microorganisms and their enzymes for nutritional improvement of feathers and other keratins as livestock feed resources[J].Bioresource Technol, 1998,66(1):1-11.

[4]傅伟.地衣芽孢杆菌降解羽毛角蛋白及其发酵产角蛋白酶的研究[D].杭州：浙江大学，2007.

[5]郭刚，楚杰，王君高，等.响应面法优化地衣芽孢杆菌S6产角蛋白酶培养基[J].饲料研究，2012（8）：31-34.

[6]GRAZZIOTIN A,PIMENTEL FA,EVDE J,et al.Nutritional improvement of feather protein by treatment with microbial keratinase[J].Anim Feed Sci Technol,2006,126(1-2):135-144.

[7]LANGEVELD J P M,WANG J J,WIEL D F M V D,et al.Enzymatic degradation of prion protein in brain stem from infected cattle and sheep [J].J Infect Dis,2003,188(11):1782-1789.

[8]HADAS A,KAUTSKY L.Feather meal,a semi-slow-release nitrogen fertilizer for organic farming[J].Nutr Cycl Agroecosys,1994,38(2):165-170.

[9]MACEDO A J,DA S W,GAVA R,et al.Novel keratinase fromBacillus subtilisS14 exhibiting remarkable dehairing capabilities[J].Appl Environ Microbiol,2005,71(1):594-596.

[10]RIESSEN S,ANTRANIKIAN G.Isolation ofThermoanaerobacter keratinophilussp.nov.a novel thermophilic,anaerobic bacterium with keratinolytic activity[J].Extremophiles,2001,5(6):399-408.

[11]高蕾蕾，李迎秋.纤维素酶及其在食品行业中的应用[J].食品工业，2017（2）：271-274.

[12]RAMNANI P,GUPTA R.Optimization of medium composition for keratinase production on feather byBacillus licheniformisRG1 using statisticalmethodsinvolvingresponsesurfacemethodology[J].Biotechnol Appl Biochem,2004,40(40):191-196.

[13]THYS R C S,GUZZON S O,CLADERA-OLIVERA F,et al.Optimization of protease production byMicrobacteriumsp.in feather meal using response surface methodology[J].Process Biochem,2006,41(1):67-73. [14]ANBU P,GOPINATH S C B,HILDA A,et al.Purification of keratinase from poultry farm isolate-Scopulariopsis brevicaulis,and statistical optimizationofenzymeactivity[J].Enzyme Microb Technol,2005,36(5-6): 639-647.

[15]YAMAMURAS,MORITAY,HASANQ,etal.Characterizationofanew keratin-degrading bacterium isolated from deer fur[J]. J Biosci Bioeng, 2002,93(6):595-600.

Q815

0254-5071（2017）05-0076-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.05.016

2017-02-23

国家自然科学基金项目（31401807）

蒋彪（1989-），男，硕士研究生，研究方向为发酵过程优化与放大。

*通讯作者：蔡俊（1968-），男，教授，博士，研究方向为微生物发酵工程。