李亚军　朱为菊　费小雯　邓晓东

摘要：[目的]分析不同抗生素和防腐剂对小球藻Chlorellasorokiniana细胞生长的影响，筛选出适宜的抗生素和防腐剂种类及其剂量，为建立小球藻C.sorokiniana无菌培养体系提供参考依据。[方法]在HSM培养基中分别添加10、20、40、60、80和100lag/mL抗生素，包括氯霉素、链霉素、青霉素、庆大霉素和头孢噻肟，以及山梨酸钾（50、100、150和200μg/mL）、乳酸钠（0.5%、1.0%和2.0%）、富马酸二甲酯（0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、25.0和50.0μg/mL）等防腐劑，培养3d后测定小球藻C.sorokiniana的细胞密度、叶绿素含量及光系统Ⅱ最大光化学量子产量（F_v/F_m）。[结果]添加10～100μg/mL青霉素或10～80μg/mL头孢噻肟对小球藻C.sorokiniana细胞密度、叶绿素含量和F_v/F_m的影响均不显著（P>0.05，下同）；添加100μg/mL头孢噻肟会抑制藻细胞生长，抑制率为18.89%，并引起叶绿素含量和F_v/F_m极显著下降（P<0.01，下同）。氯霉素、链霉素和庆大霉素等蛋白质合成抑制类抗生素对小球藻C.sorokiniana细胞的毒性较强，高于10μg/mL的链霉素和庆大霉素及高于20μglmL的氯霉素均极显著抑制藻细胞生长，对应的叶绿素含量和F_v/F_m也极显著下降。3种防腐剂中，山梨酸钾对小球藻C.sorokiniana细胞生长无显著影响，添加200μg/mL山梨酸钾还会促进细胞叶绿素含量增加；乳酸钠对小球藻C.sorokiniana细胞有一定的毒性作用，其藻细胞密度、叶绿素含量和F_v/F_m随添加浓度增加而降低；添加0.1～10.0μg/mL富马酸二甲酯不影响小球藻C.sorokiniana的细胞密度及叶绿素含量，但F_v/F_m极显著下降。[结论]建立小球藻C.sorokiniana无菌培养体系时宜选用青霉素和头孢噻肟为抗生素、山梨酸钾为防腐剂，其推荐使用浓度分别为青霉素100μg/mL、头孢噻肟80μg/mL、山梨酸钾200μg/mL。

关键词：小球藻Chlorellasorokiniana；抗生素；防腐剂；细胞密度；叶绿素含量；F_v/F_m

中图分类号：S963.213 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2017）11-2078-08

0引言

[研究意义]小球藻为一类单细胞真核生物，是绿藻门、绿藻纲、绿球藻目、小球藻科、小球藻属各种类的统称，常见种类有普通小球藻（Chlorellavulgar-is）、椭圆小球藻（C.ellipsoidea）和蛋白核小球藻（C.pyrenoidosa）等，其变种可达上百种。因其富含蛋白质、脂类、多糖和各种活性代谢产物，在医药保健、食品工业和水产动物饵料等方面具有极高的应用价值（孔维宝等，2010；罗柳茵等，2016）。获得小球藻纯种资源是其推广应用的前提，但在藻种资源分离、培养及保存过程中，通常存在其他杂菌污染，而添加抗生素和防腐剂抑制杂菌生长是获得小球藻纯种最有效的途径。不同藻种对抗生素和防腐剂的耐受力也各不相同，因此，筛选出适宜的抗生素和防腐剂种类及其剂量是建立小球藻无菌培养体系的关键。[前人研究进展]至今，已有10余种抗生素应用于微藻的无菌化培养，如常见的氯霉素、氨苄青霉素和卡那霉素等。微藻对抗生素的敏感性与其种类密切相关。莱茵衣藻、栅藻、单针藻、埃氏小球藻对氯霉素较敏感，超过20μg/mL即可抑制藻类细胞生长（杨芳芳等，2012；余旭亚等，2012；姜思等，2017；王亚君等，2017），但对普通小球藻和富油新绿藻不敏感，即使100μg/mL氯霉素也未影响其生长（周文礼等，2009；张茜等，2016）。大多数藻种如小球藻、小硅藻、塔胞藻、雨生红球藻、莱茵衣藻、富油新绿藻和波吉卵囊藻对氨苄青霉素和青霉素均不敏感，对卡那霉素则较敏感（岳伟萍，2005；李静红等，2009；张茜等，2016；姜思等，2017；王亚君等，2017；郑凌凌等，2017）；但也有研究报道小球藻藻种Chlorellasp.对青霉素敏感（麻晓霞等，2011）。低剂量四环素会抑制莱茵衣藻细胞的生长，但富油新绿藻不受其影响（姜思等，2017）。此外，Guo等（2016）研究发现，100μg/mL头孢菌素（7-氨基头孢霉烷酸）对小球藻、莱茵衣藻和麦可藻的生长抑制率分别为12.0%、9.6%和11.7%；Teixeira和Granek（2017）通过对比等鞭金藻、微拟球藻和角毛藻对抗生素甲氧苄氨嘧啶和磺胺甲恶唑的抗性，发现仅微拟球藻细胞生长受这两种抗生素的抑制。[本研究切入点]海南具有丰富的藻种资源，但可商业化利用的纯藻种非常少，尤其从自然水体中分离获得的藻种通常带有很多其他杂菌，藻细胞生长易受限制，且其培养液存储时间非常短，一般3--4d即开始腐败。因此，非常有必要在小球藻培养体系中添加抗生素和防腐剂以去除杂菌，进而提高小球藻生长速率和延长藻液存储时间。[拟解决的关键问题]从自然水体中分离获得一株小球藻，为推进其在水产动物饵料和食品添加剂领域中的应用，而急需获得纯藻种。通过分析不同抗生素（氯霉素、链霉素、青霉素、庆大霉素和头孢噻肟）和防腐剂（山梨酸钾、富马酸二甲酯和乳酸钠）对小球藻细胞生长的影响，筛选出适宜的防腐剂种类及其剂量，为建立小球藻无菌培养体系提供参考依据。

1材料与方法

1.1试验材料

小球藻藻种由农业部热带作物生物学与遗传资源利用重点实验室采用平板分离法从自然水体中分离得到，命名为HOC5。HSM培养基配方：NH4C10.50g/L、MgSO₄·7H₂O0.02g/L、CaCl₂·2H₂O0.01g/L、K₂HPO₄1.44g/L、KH₂PO₄0.72g/L和CH₃COOK2.00g/L。氯霉素、链霉素、青霉素、庆大霉素和头孢噻肟购自美国mmresco公司，其试验浓度梯度为10、20、40、60、80、100μg/mL，每个浓度梯度重复3次。山梨酸钾、富马酸二甲酯和乳酸钠购自上海麦克林生化科技有限公司，其中，山梨酸钾是根据GB2760-2014的相关规定，设50、100、150和200μg/mL4个浓度梯度；富马酸二甲酯是参考吴晖等（2007）的方法，设0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、25.0和50.0μg/mL7个浓度梯度；乳酸钠则根据预试验结果，设0.5%、1.0%和2.0%3个浓度梯度。

1.2DNA提取及藻种鉴定

将培养1周左右的藻种接种到50mL的HSM液体培养基中，于27℃下摇床（230r/min）培养3d。5000r/min离心5min，收集藻种，并置于研钵中加入适量石英砂，液氮研磨。取适量藻粉置于2mL离心管中，加入150μL无菌水、300μLSDS抽提液（2%SDS、400mmol/LNa2EDTA、100mmol/LTris-HCl，pH8.0）和5μLRNase（20μL/μL），混匀后室温静置15min。12000r/min离心10min，取上清液，以苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）和氯仿：异戊醇（24：1）依次各抽提一次。抽提获得的DNA用无水乙醇沉淀，70%乙醇洗涤一次后加入40μL无菌水溶解。

参照孙雪等（2009）的方法合成小球藻rDNAITS引物（ITS-F：5'-TTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAG-3'和ITS-R：5'-TTAAGTTCAGCGGGTAGTCTTGCC-3'）及rbcL引物（rbcL-F：5'-ATGKCTCCACAAACTGAAACTA-3和rbcL-R：5'-TTAAAGWGTATCGATWGTTTCGA一3）。利用PCR扩增小球藻的ITS序列和rbcL基因，并将其克隆至pMD18-T载体，挑选阳性克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序。测序结果在NCBI数据库（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中检索，并采用MEGA5.2构建基于ITS和rbeL基因序列同源性的系统发育进化树。

1.3小球藻细胞密度测定

每瓶培养基中加人1mL藻种（5×10⁶个/mL），培养3d后采用血球计数板测定各处理的藻细胞密度，并计算细胞抑制率：

抑制率（%）=（C₀-C）/C₀×100

式中，C₂表示未添加抗生素的小球藻细胞密度，C表示添加不同浓度抗生素后的小球藻细胞密度。

1.4叶绿素含量及F_v/F_m测定

取1mL小球藻培养液置于10mL玻璃管中，每管加入4mL丙酮，涡旋振荡30s，4℃静置1h后5000r/min离心5min，取上清液于波长645和663nm处测定吸光值，计算叶绿素含量：

叶绿素含量（mg/L）=（20.2×OD_645nm+8.02×OD_663nm）×V/1000

式中，V表示丙酮體积。

光系统Ⅱ最大光化学量子产量（F_v/F_m）反应植物潜在的最大光合能力，直接采用便携式调制叶绿素荧光仪（mini-PAM）进行测定。

1.5统计分析

试验数据采用SPSS19.0进行单因素方差分析（One-wayANOVA）和LSD多重比较分析。

2结果与分析

2.1小球藻藻种鉴定结果

以小球藻DNA为模板，PCR扩增获得HOC5的ITS和rbcL基因序列长度分别为683和1429bp。ITS序列的同源性比对分析结果显示，HOC5与小球藻科小球藻属的Chlorellasorokiniana亲缘关系最近（图1）。基于rbcL基因同源性构建的系统发育进化树也显示出类似结果（图2）。HOC5的细胞形态如图3所示，为单细胞，浮游，呈圆形或椭圆形，色素体1个，环状周生，细胞直径4.5～5.5lam。综合分子生物学和形态学鉴定结果，可将HOC5鉴定为Csorokiniana。

2.2不同抗生素对小球藻C.sorokiniana细胞密度的影响

小球藻C.sorokiniana在添加不同浓度抗生素的培养基中培养3d后，其细胞密度如图4所示。与未添加抗生素（0μg/mL）的对照相比，添加10～100μg/mL青霉素并不影响小球藻C.sorokiniana细胞的生长；添加10-80μg/mL头孢噻肟也不影响小球藻C.sorokiniana细胞增殖，但添加浓度达100μg/mL时，藻细胞密度明显下降，该浓度对藻细胞生长的抑制率达18.89%（表1）；添加低浓度的氯霉素（0-20μg/mL）能有效促进藻细胞生长，当浓度超过20μg/mL后，藻细胞密度随氯霉素添加浓度的增加而呈急剧下降趋势，80和100μg/mL氯霉素对藻细胞生长的抑制率分别为20.94%和39.87%（表1）；链霉素和庆大霉素的添加浓度超过10μg/mL时，藻细胞生长受到严重抑制，抑制率分别为34.10%-54.64%和41.73%-64.30%（表1）。从图5也可看出，与对照的深绿色培养液相比，藻细胞生长受抑制的培养液均呈浅绿色，尤其在添加60μg/mL及以上浓度的庆大霉素培养液中，培养液几乎透明，其对应的抑制率均超过60.00%。

2.3不同抗生素对小球藻C.sorokiniana光合作用的影响

由图6可看出，小球藻C.sorokiniana的叶绿素含量与细胞密度的变化趋势基本一致。与未添加抗生素（0μg/mL）的对照相比，添加青霉素基本上不影响小球藻C.sorokiniana的叶绿素含量；添加20μg/mL及以上的庆大霉素和链霉素进行培养时，小球藻C.sorokiniana的叶绿素含量呈极显著下降趋势（P<0.01，下同）；添加60μg/mL及以上的氯霉素进行培养时，小球藻C.sorokiniana的叶绿素含量呈显著（P<0.05，下同）或极显著下降趋势；添加10～80μg/mL头孢噻肟进行培养时，小球藻C.sorokiniana的叶绿素含量无显著变化（P>0.05，下同），但添加浓度增至100μg/mL后，其叶绿素含量极显著下降。

由图7可看出，添加青霉素对小球藻C.sorokinia-na的F_v/F_m无显著影响。与正常培养的小球藻C.so-rokiniana相比，添加20和40μg/mL庆大霉素培养的小球藻F_v/F_m极显著下降，而添加60-100g/mL庆大霉素培养的小球藻C.sorokiniana因其细胞密度过低，未检测出F_v/F_m；添加60-100g/mL氯霉素和链霉素能极显著降低小球藻C.sorokiniana的F_v/F_m。

2.4不同防腐剂对小球藻C.sorokiniana细胞密度的影响

由图8可看出，添加0.5%和1.0%乳酸钠尚未明显阻碍小球藻C.sorokiniana细胞的生长，但添加2.0%乳酸钠后藻细胞密度下降50%左右；培养液中添加50-200μg/mL山梨酸钾对藻细胞密度无显著影响；小球藻C.sorokiniana培养液添加富马酸二甲酯的适宜浓度为0.1～10.0μg/mL，添加浓度为25.0和50.0μg/mL时藻细胞几乎不能生长（图9）。

2.5不同防腐剂对小球藻C.sorokiniana光合作用的影响

由图10可看出，乳酸钠会降低小球藻C.soroki-niana的叶绿素含量，添加2.0%乳酸钠时其叶绿素含量极显著下降；添加山梨酸钾对小球藻C.sorokiniana的叶绿素含量无显著影响；添加0.1-10.0μg/mL富马酸二甲酯也不影响小球藻C.sorokiniana的叶绿素含量，但添加浓度超过25.0μg/mL后叶绿素含量极显著下降。在F_v/F_m方面，添力10.5%-2.00/4L酸钠及0.5-10.0gg/mL富马酸二甲酯培养的小球藻C.sorokiniana，其F_v/F_m较未添加防腐剂（0μg/mL）的对照极显著下降，表明潜在的最大光合能力受到抑制。

3讨论

青霉素主要通过抑制转肽酶阻碍细菌的细胞壁合成，从而达到抗菌目的；头孢噻肟为第三代头孢菌素，与青霉素同属于β-内酰胺类抗生素。本研究结果表明，小球藻C.sorokiniana对这两种抗生素不敏感，仅高浓度（100μg/mL）的头孢噻肟会引起藻细胞密度和叶绿素含量下降，同时潜在的最大光合能力极显著下降。除小球藻外，波吉卵囊藻和富油新绿藻对青霉素也不敏感（李静红等，2009；张茜等，2016），但周文礼等（2009）报道低于100μg/mL的青霉素能促进普通小球藻叶绿素a含量增加。本研究也发现青霉素对小球藻C.sorokiniana细胞叶绿素含量无显著影响，可能是藻种不同的原因。头孢噻肟为7一氨基头孢霉烷酸（7ACA）的衍生物，二者抗菌机制相似。Guo等（2016）报道100μg/mL7一氨基頭孢霉烷酸对小球藻Chlorellasp.的抑制率为12.00%，本研究中100μg/mL头孢噻肟对小球藻C.sorokiniana的抑制率为18.96%，但Fu等（2017）研究证实细菌细胞壁合成抑制类抗生素（头孢噻肟和氨苄青霉素）对微藻的毒性作用很小。不同藻种对抗生素的敏感性各不相同，除了与其种属有关外，还与培养基的组分有关。李杰等（2003）、杨芳芳等（2012）曾研究报道，以固体和液体培养基培养获得的微藻对同一抗生素的敏感性也不相同。

氯霉素和链霉素的抗菌作用机制是分别与细菌核糖体蛋白的50S和30s亚基相结合，使细菌蛋白质合成受阻，而达到抑菌目的。庆大霉素与链霉素的抗菌作用机制相似，也是与细菌核糖体蛋白30S亚基相结合，只是庆大霉素较链霉素具有更广的抗菌谱和更强的抗菌活性。已有研究证实，莱茵衣藻、栅藻、埃氏小球藻和单针藻对氯霉素非常敏感（余旭亚等，2012；姜思等，2017；王亚君等，2017），但也有研究报道真眼点藻、富油新绿藻、金藻和普通小球藻对100μg/mL及以下浓度的氯霉素不敏感（周文礼等，2009；杨芳芳等，2012；张茜等，2016）。Seoane等（2014）研究发现，培养基中添加氯霉素24h后，绿藻Tetraselmissuecica的生长和细胞活性均未受影响，但与光合作用相关的各项参数，如叶绿素a含量显著下降，表明氯霉素对T.suecica有一定毒性。在链霉素和庆大霉素方面，Magdaleno等（2015）研究表明庆大霉素对月牙藻的毒性作用非常大，半数有效浓度（EC₅₀）为19.2mg/L；张茜等（2016）、王亚君等（2017）研究发现富油新绿藻、埃氏小球藻和单针藻对链霉素非常敏感；郑凌凌等（2017）研究证实雨生红球藻对链霉素和庆大霉素均非常敏感。本研究结果表明，氯霉素、链霉素和庆大霉素等蛋白质合成抑制类抗生素对小球藻C.sorokiniana细胞的毒性较强，高于10μg/mL的链霉素和庆大霉素及高于20μg/mL的氯霉素均极显著抑制小球藻C.sorokiniana细胞生长，对应的叶绿素含量和F_v/F_m也极显著下降。

山梨酸钾为常用的食品防腐剂。孙建华等（1998）曾报道，山梨酸钾可用于高浓度小新月菱形藻的保存。本研究结果表明，添加50-200μg/mL山梨酸钾不会影响小球藻C.sorokiniana生物量的累积，当添加浓度达200μg/mL时藻细胞密度略有增加，潜在的最大光合能力也明显上升。乳酸钠和富马酸二甲酯尚无应用于微藻无菌培养及保存的研究报道。本研究发现，小球藻C.sorokiniana的细胞密度、叶绿素含量及F_v/F_m均随乳酸钠浓度增加而降低，表明乳酸钠对小球藻C.sorokiniana细胞有一定的毒性作用；添加0.1-10.0μg/mL富马酸二甲酯不影响小球藻C.sorokiniana的细胞密度及叶绿素含量，但F_v/F_m极显著下降，表明富马酸二甲酯会抑制小球藻C.sorokiniana潜在的最大光合能力。

4结论

青霉素和头孢噻肟等破坏细菌细胞壁合成的抗生素对小球藻生长影响较小，而氯霉素、链霉素和庆大霉素等抑制细菌蛋白质合成的抗生素对小球藻毒性较大。山梨酸钾不影响小球藻的生长，乳酸钠会抑制小球藻细胞生长，且添加浓度越高抑制作用越明显。因此，建立小球藻C.sorokiniana无菌培养体系时宜选用青霉素和头孢噻肟为抗生素、山梨酸钾为防腐剂，其推荐使用浓度分别为青霉素100μg/mL、头孢噻肟80μg/mL、山梨酸钾200μg/mL。

（责任编辑兰宗宝）