于海芹　饶思莲　赵丹阳　刘勇　李永平

摘要：[目的]系统了解烟草种质资源T1203抗烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）的特点，为烟草抗病育种的亲本选择提供更丰富信息。[方法]以烟草种质资源T1203为材料，采用TMV病毒接种、病情调查、病毒外壳蛋白累计量检测、TMV复制水平测定及日灼现象观察等方法，研究T1203对TMV的抗性特异性、T1203接种TMV普通株系（TMV-U1株系）后的症状、病毒复制水平等。[结果]T1203只对TMV表现无症状的抗病特点，接种马铃薯Y病毒（PVY）和黄瓜花叶病毒（CMV）则表现出典型症状。接种TMV-Ul株系后14d，Western blotting检测结果显示，T1203叶片病毒复制水平明显低于对照品种；用表达GFP的TMV侵染性克隆浸润接种发现，T1203对TMV的抗性发生在病毒复制水平。在高温和强日照条件下，T1203生长迅速的中上部叶片会发生日灼现象，且难以恢复。[结论]T1203只对TMV表现无症状，其对TMV的抗性发生在病毒复制水平。

关键词：烟草种质；T1203；烟草花叶病毒（TMV）；抗病性

中图分类号：S286.3 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2017）11-2004-06

0引言

[研究意义]烟草花叶病毒病是我国烟草上的重要病害，每年造成的损失位列十大侵染性病害前茅（刘勇等，2006），种植抗病品种是防控烟草花叶病于海芹等：烟草种质资源T1203对烟草花叶病的抗性特点毒（Tobacco mosaic virus，TMV）最经济、有效的手段（许石剑等，2009）。研究表明，烤烟品种TMV抗性由一个显性单基因州空制，N基因来源于烟草野生种心叶烟（Nicotiana glutinosa）（Holmes，1960），通过一系列的回交转育和常规杂交，心叶烟中包含N基因的染色体片段转育至香料烟中，然后转育至白肋烟和烤烟品种中（Chaplin and Gooding，1969；Chaplinand Mann，1978；Beekwilder，1999）。虽然Ⅳ基因可有效抑制TMV的复制和传播，但包含Ⅳ基因的染色体片段存在与Ⅳ基因高度连锁控制不利性狀的基因，不利性状表现为相对较低的产量、贪青晚熟等，限制了包含Ⅳ基因的种质资源在育种中的使用。因此，有必要寻找新的抗TMV种质资源，以便提高烟草的TMV抗性且无不利性状。[前人研究进展]Nolla和Roque于1933年在哥伦比亚研究发现，无Ⅳ基因烟草种质Ambalema接种TMV后无感染TMV的典型症状，但可检测到少量病毒。后来Valleau（1952）将Ambalema的抗病类型称为无症状（Symptomless）。1969年Chaplin和Goodling在对907份烟草资源接种TMV进行抗性鉴定时发现，除了常见的过敏性坏死反应抗病表型和花叶症状外，还发现更多烟草种质表现无症状。陈海如和范静华（1991）报道，烟草种质Ambalema接种TMV后表现无症状，但从植株各叶龄叶片上均能检测出TMV。Beekwilder（1999）将从无症状叶片中提取的汁液接种到TMV枯斑寄主上，3-7d后接种叶出现坏死斑，证明无症状个体虽然肉眼看不出明显的感病症状，但叶片中存在TMV。Yuan等（2015）报道了几种在接种TMV后表现为无症状的野生烟草，包括Ⅳcavicola（PI 271990）、N.glauca（PI 282690）、N.noctiflora（PI 417918）、N.af-ricana（PI 555472）、N.benavidesii（PI 555477）和N.raimondii（PI 555549）。这种无症状表型可看成一种抗病反应，有的文献将T1203和Ambalema等无症状资源视为抗TMV资源（Beekwilder，1999）。胡群（2016）研究表明，T1203等烟草品种对TMV的无症状表型是由两个拷贝的隐性基因控制，控制无症状基因的克隆可促进此类资源在育种中的利用。[本研究切入点]T1203是我国引进的高抗TMV种质资源，其对TMV侵染表现无症状，可应用于烟草的抗TMV育种。虽然前人对无症状烟草种质资源已有一些研究，但针对T1203资源的系统研究未见文献报道。[拟解决的关键问题]通过TMV接种、病情调查、病毒外壳蛋白累计量检测、TMV复制水平测定及日灼现象观察等探究烟草种质资源T1203的TMV抗性特点，以期为烟草抗病育种的亲本选择提供更丰富的信息。

1材料与方法

1.1试验材料

供试烟草品种：T1203（无症状表型品种）、Coker176（高抗品种）、K326（普通烟对照）和中烟100（感病对照）。毒源：TMV-U1株系（TMV-U1）、黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）、马铃薯Y病毒（Potato virus Y，PVY）和表达GFP的TMV侵染性克隆。

1.2试验方法

1.2.1病毒接种与病情调查 在温室内按常规方法漂浮育苗，苗龄50d左右，在小花盆中每份定植18株，每盆1株，采用棉签摩擦接种病毒。具体方法：采集经免疫检测试纸条检测无污染的毒源新鲜病叶，于无菌研钵中用接种缓冲液（0.01mol/LpH7.0磷酸盐缓冲液）研磨，双层纱布过滤，调整接种液浓度为1：100（重量体积比，g/L），在病毒汁液中加入过0.075mm筛孔的1%SiO₂；用棉签取病叶汁液，每株摩擦接种2片叶。接种后第5和7d以株为单位调查接种叶是否有枯斑；接种后10、14、21、28、35和40d调查花叶等症状发生情况。

试纸条检测法：采用Agdia公司（www.agdia.com）的TMV检测试纸条（Imuno-strip）进行检测，方法参考试剂说明书。

1.2.2病毒外壳蛋白累计量检测 参照于翠（2004）的方法，利用TMV和CMV的外壳蛋白单克隆抗体，检测接种病毒后烟草叶片中的病毒外壳蛋白累积量。

1.2.3TMV复制水平测定 参照Donson等（1991）的方法，将表达GFP的TMV侵染性克隆导人农杆菌菌株EHAl05，将农杆菌稀释500倍浸润接种5叶期的普通烟对照K326和T1203下部叶片，并在荧光显微镜下观察浸润叶片重组病毒中GFP的表达情况。参照Yu等（2004）的方法分别制备T1203和K326的叶片原生质体细胞，利用TMV侵染性体外转录本，通过电极法转染原生质体，2d后Trizol法提取原生质体总RNA，设计TMV特异性引物进行荧光定量反转录PCR（qRT-PCR）测定TMV基因组复制水平；以烟草Actin基因为内参基因。

1.2.4日灼现象观察 常规方法田间移栽T1203和K326，每份材料移栽20株。观察烟草植株的生长情况及叶片在强日照天气下是否出现萎蔫和枯死。

2结果与分析

2.1T1203接种TMV后叶片症状及病毒检测结果

塑料大棚内盆栽T1203、Coker176、K326和中烟100苗期接种TMV-U1株系，高抗TMV的枯斑资源Cokerl76在接种5d后其接种叶片表现枯斑，持续调查至接种后40d，非接种叶无症状（表1）；K326和中烟100接种后14d开始表现典型花叶，接种后第28d植株明显矮化（图1），接种40d后上部非接种叶表现典型花叶、畸形和矮化等症状（图2）；T1203接种TMV后14d叶片无症状表现，接种后28d亦无花叶、畸形和矮化等症状，上部非接种叶TMV免疫试纸条检测为TMV阳性，接种后第40d非接种叶表现轻微的黄色斑驳（表1、图1和图2）。

2.2抗性特异性检测及病毒外壳蛋白积累量检测结果

为检验T1203是否对侵染烟草的PVY和CMV表现症状，在光照培养室内分别采用摩擦接种TMV、PVY和CMV，结果显示，接种TMV后14d，对照普通烟K326全部表现花叶，T1203无症状；接种PVY和CMV后14d，K326和T1203均表现明显的花叶、叶片狭窄等典型症状（未列出图片）。表明T1203对TMV的无症状表型具有特异性。

光照培养室内接种后14d，利用TMV单克隆抗体对非接种叶片的TMV外壳蛋白（CP）积累量进行检测，结果表明，T1203叶片中TMV-CP含量明显低于对照K326；利用CMV单克隆抗体对非接种叶片的CMV外壳蛋白（CP）积累量进行检测，结果表明，T1203叶片中CMV-CP含量与对照K326相当（图3）。非接种叶病毒外壳蛋白积累量检测结果显示，光照培养室内接种后14d，T1203叶片中TMV病毒积累量较对照K326低，与无症状表型吻合；T1203叶片中CMV病毒積累量与对照K326相当，与花叶症状表型吻合（未列出图片）。

2.3TMV复制水平测定结果

为明确T1203抗TMV的机理，利用表达GFP的TMV侵染性克隆分析抗性发生水平，该侵染性克隆不能系统侵染普通烟，仅可在浸润细胞内复制（Don-son et a1.，1991）。表达GFP的TMV侵染性克隆浸润接种7和10 d后，K326的浸润叶可观察到离散的绿色荧光，而T1203浸润叶未观察到绿色荧光（图4），说明T1203对TMV的抗性水平发生在病毒复制水平。利用TMV侵染性体外转录本，通过电极法转染原生质体，然后通过定量PCR测定原生质体中TMV负链基因组RNA积累水平，结果发现T1203原生质体中TMV的复制量仅为K326的20%（图5），进一步验证T1203对TMV的抗性发生在病毒复制水平。

2.4日灼现象观察结果

T1203在25℃以上的强光照射下，生长迅速的上部新展开叶易发生日灼现象，表现为叶片上部萎蔫，随后萎蔫部位枯死。K326等感TMV对照品种偶尔表现上部叶片萎蔫的日灼症状，但萎蔫症状大部分能恢复（图6）。

3讨论

近年来，针对T1203等无症状资源的研究较少。陈海如和范静华（1991）研究了病毒在T1203不同叶龄叶片中的分布情况，胡群（2016）对控制T1203无症状表型的基因进行研究，而本研究通过TMV病毒接种、病情调查、病毒外壳蛋白累计量检测、TMV复制水平测定及日灼现象观察等分析T1203对TMV的抗性特异性、T1203接种TMV普通株系（TMV-U1株系）后的症状、病毒复制水平等，更系统地探究了烟草种质资源T1203抗TMV的特点，为烟草抗病育种的亲本选择提供了更丰富的信息。

本研究苗期接种试验结果显示，T1203接种TMV-U1株系早期（接种后28d内）叶片无枯斑、花叶和斑驳等明显症状，因此被称为无症状抗病类型。T1203接种TMV-U1株系的无症状表型受接种后时间、光照和温度等影响，接种后28d内T1203表现为无症状；接种后28d开始，在较高温度和光照条件下，T1203幼嫩叶片表现轻微的黄色斑驳症状，但烟株无花叶、畸形和矮化等症状。与感病的K326典型TMV症状相比较，T1203的症状轻微，K326未感染TMV的烟株幼嫩叶片有时也表现轻微的黄色斑驳，因此，由于肉眼观察的局限性，T1203接种后期幼嫩叶片轻微的黄色斑驳症状可能被忽视。本研究结果表明，T1203的无症状现象对TMV具有特异性，对PVY和CMV无此现象发生。Chaplin和Gooding（1 969）发现T125、T1383、T1384、T1407、T1410、T1411、T1412、T1413、T1436、T1437、T1438、T1439、T1448、T1448A、T1449、T1450、T1465、T1468、T1470、T1471、T1692、T11203和T11467等25份烟草资源对TMV表现无症状，这些资源被称为Ambalema类抗TMV资源。胡群（2016）研究表明，T1203对TMV的无症状表型由2个拷贝的隐性基因控制，且T1203非接种叶片中的TMV含量较低。病毒复制水平低和病毒移动出接种叶受阻均可导致非接种叶中病毒含量低。本研究病毒侵染性克隆浸润接种、原生质体病毒RNA含量检测结果表明，非接种叶病毒含量低很可能发生在病毒复制水平。鉴于接种TMV表现无症状的资源叶片内存在较低浓度的TMV，建议将此类资源称为耐病资源（Disease tolerance），以便与常见的抗病性相区分。

研究中发现T1203较K326等对照易发生日灼现象。Valleau（1952）研究发现Ambalema有隐症现象，高温时也会出现日灼现象，且难以恢复；Nolla和Roque等（1933）研究发现Ambalema接种TMV后有空茎现象，但是否属于隐症现象的并发症还有待进一步研究。

T1203接种TMV后，前期表现为无症状且叶片病毒累积量低、后期非接种幼叶表现轻微的黄色斑驳症状、高温和强日照条件下容易出现不可恢复的日灼现象，这些特点限制了T1203这类无症状资源作为抗TMV资源的育种利用。

4结论

本研究结果表明，烟草种质资源T1203只对TMV表现无症状的抗病特点，接种PVY和CMV表现典型感病症状，且T1203对TMV的抗性发生在病毒复制水平。在高温和强日照条件下，T1203生长迅速的中上部叶片会发生日灼现象，且难以恢复。

（责任编辑麻小燕）