刘祥 刘淑瑛 虎娟 张虹 张自萍 陈任

摘 要 杜仲生产的反式-1，4-聚异戊二烯橡胶（杜仲胶）是由异戊二烯单元聚合形成的不同分子大小的混合物，主要沉积于细胞的空隙之间，提取困难。为正确分析测定杜仲材料中杜仲胶的含量，以杜仲果翅为材料，采用氯仿、石油醚和甲苯3种有机溶剂，配合超声波处理组成6种不同的提取方法，以杜仲胶的提取得率以及分子量分布为衡量标准，对杜仲胶的分析测定方法进行比较。结果表明，采用氯仿作为有机溶剂，杜仲胶提取得率明显高于其他方法，可达到7.47%；氯仿配合超声波处理，会更进一步促进小分子或大分子杜仲胶聚合物的溶出和提取，所得杜仲胶的分子量分布范围更宽，分子量分布指数可达9.99。

关键词 杜仲；杜仲胶；反式-1，4-聚异戊二烯；有机溶剂；索氏提取法；分子量分布；凝胶渗透色谱

中图分类号 Q946.8 文献标识码 A

Abstract The trans-1，4-polyisoprene rubber produced by Eucommia ulmoides Oliver（Eucommia-rubber）， which consists of different molecular sizes of polymers polymerized from the isoprene units， mainly accumulates in the cell gaps and is difficult to extract. To develop an effective method for the analysis of eucommia-rubber from E. ulmoides， the winged perianths were used as the material， and six pressing methods comprised three kinds of organic solvents， chloroform， petroleum ether and toluene assisted sonication were tested. The extraction efficiency was evaluated by the extraction rate and the molecular weight distribution of extracted eucommia-rubber. The results showed that using chloroform as the organic solvent， the extraction rate was 7.47%， which was significant higher than others， and using chloroform assisted sonication， a quantity of small and big molecular of eucommia-rubber could be more efficiently dissolved and extracted， reflecting that its molecular weight distribution index was up to 9.99. Our research would supply a favorable technique for the extraction and analysis of trans-polyisoprene rubber.

Key words Eucommia ulmoides； eucommia-rubber； trans-polyisoprene； organic solvent； soxhlet extraction； molecular weight distribution； gel permeation chromatography

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.04.021

天然橡胶是事关国计民生和国家安全的重要战略物资，与石油、铁矿石、有色金属并称四大工业原料。天然橡胶的主要成分为1，4-聚异戊二烯（1，4-polyisoprene），根据其聚合方式，有顺式（cis-）和反式（trans-）两种同分异构体[1-2]。具有顺式-1，4-聚异戊二烯生物合成能力的植物较多，最著名的且唯一在生产上应用的是适合于热带地区种植的巴西橡胶树（Hevea brasiliensis Müll. Arg.）。而具有反式-1，4-聚异戊二烯生物合成能力的植物极少，只有巴拉塔树（Mimusops balata Crueg. ex Griseb.）、古塔波橡胶树（Palaquium gutta Baill）[3-4]和杜仲（Eucommia ulmoides Oliv.）[5-6]等数种。反式-1，4-聚异戊二烯橡胶不同于顺式-1，4-聚异戊二烯橡胶具有弹性，是一种类似于硬质塑料的坚韧物质，因绝缘性好，具有耐磨、耐酸碱、抗撞击等特点，是制造海底电缆、工业填充材料的优良原料[7-9]。另外，由于近年来我国在杜仲反式-1，4-聚异戊二烯橡胶（杜仲胶，Eucommia-rubber）的加工工艺上取得了突破，利用杜仲胶独具的橡（胶）塑（料）二重性，通过控制硫化交联度的高低可以把杜仲胶分别改造成为热塑性、热弹性和高弹性材料，不仅可以作为弹性的顺式-1，4-聚异戊二烯橡胶的替代品，而且与塑料、其他橡胶混合使用，在高速节能轮胎、纳米磁性导电材料、形状记忆塑料、新型医用材料、防辐射材料以及声纳吸收和反射材料等特殊方面的用途不断被研发出来，应用前景非常广阔[10-13]。

在杜仲遗传改良等科研和生产实践中，经常需要评价杜仲不同产地、不同植株或不同组织之间杜仲胶含量的差异。但是，由于杜仲的韧皮部没有乳管结构，杜仲胶主要沉积于细胞的空隙之间，提取分离比较困难[14]。而且聚异戊二烯不是单一分子构成的物质，而是由异戊二烯单元（isoprene unit， C5H8）聚合形成的不同分子大小的混合物，分子量分布一般在103～106之间[5]，故从杜仲植物体内或组织内提取和分析杜仲胶含量时需要关注两个指标，即杜仲胶的提取量（或称为得率）以及提取到的杜仲胶的分子量。二者既是评价杜仲植株或组织生产杜仲胶的数量和质量，也是反映分析测定方法优劣的指标。譬如采用不同提取方法分析同一材料时，如果提取得率越高，分子量分布越宽，则说明提取越充分，分析结果越准确。目前对杜仲胶的分析测定主要侧重于提取量（以此计算含胶量），而同时兼顾到这两个指标的提取和分析方法尚未见报道。本实验以杜仲果翅（或称种莢）为材料，利用3种有机溶剂，配合超声波处理组成6种不同的提取方法，以杜仲胶的提取得率以及分子量分布为衡量标准，对其结果进行比较，为正确分析测定杜仲植株或组织材料中的杜仲胶含量提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 原料 果实成熟后于10月底采收阴干，保存于-85 ℃冰箱备用。

1.1.2 试剂 石油醚（天津富宇精细化工有限公司，分析纯，沸程为90～120 ℃）、甲苯（天津富宇精细化工，分析纯）、甲醇（天津富宇精细化工，分析纯）、无水乙醇（天津富宇精细化工，分析纯）、氢氧化钠（西陇化工，分析纯），氯仿（美国迈瑞达，色谱纯）。

1.1.3 仪器与设备 电子天平（美国奥豪斯仪器，CP224C），索氏提取器（规格为250 mL），超声波清洗器（宁波新芝生物科技，SB5200），旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器，RE-52A），真空干燥箱（上海一恒科学仪器，DZF-6021），凝胶渗透色譜仪（日本东曹，HLC-8320GPC）。

1.2 方法

1.2.1 材料研磨处理 杜仲果实去除种子，剥出果翅冷冻干燥一晚后，用液氮辅助充分研磨，精确称取6份样品，重量各为1 g。

1.2.2 材料碱处理 将每份样品浸泡于10%的氢氧化钠沸水浴中，处理3 h，用去离子水冲洗沉渣至中性后，40 ℃低温下烘干。

1.2.3 材料乙醇处理 每份样品继续加入100 mL无水乙醇，连接索氏提取器进行沸水浴处理6 h后，低温烘干。

1.2.4 杜仲胶提取 利用3种有机溶剂，配合超声波处理组成以下6种不同的方法溶解、提取样品中的杜仲胶。方法1：加入100 mL氯仿，在80 ℃水浴下索氏提取6 h；方法2：加入100 mL氯仿，60 ℃，40 kHz超声波处理40 min后，在80 ℃水浴下索氏提取6 h；方法3：加入100 mL石油醚，在80 ℃水浴下索氏提取6 h；方法4：加入100 mL石油醚，60 ℃，40 kHz超声波处理40 min后，在80 ℃水浴下索氏提取6 h；方法5：加入100 mL甲苯，在80 ℃水浴下索氏提取6 h；方法6：加入100 mL甲苯，60 ℃，40 kHz超声波处理40 min后，在80 ℃水浴下索氏提取6 h。

1.2.5 杜仲胶精制 将提取液转移至离心管中，4 000 r/min离心数次至干燥状，收集提取液。利用旋转蒸发仪将提取液蒸干，真空干燥。加入5 mL甲醇润洗数分钟，再次真空干燥即得到精制的杜仲胶制品，精确称其重量。

1.2.6 杜仲胶提取得率分析 计算方法如下：

n=W1/W0×100%

式中n为杜仲胶提取得率（%）；W1为提取精制后的杜仲胶质量（g）；W0为杜仲样品的质量（g）。

1.2.7 杜仲胶的分子量分布分析 称取0.02 g精制的杜仲胶制品，加入10 mL氯仿（流动相），密封并遮光使之溶解约12 h后，0.45 μm微孔滤膜过滤，得到2 mg/mL的样品溶液。利用凝胶渗透色谱（GPC）仪进行分子量分布分析。

标准溶液，已知Mw为1.0×103～1.2×106的cis-1，4-Polyisoprene标准品，加入氯仿（流动相）制成的1 mg/mL标准溶液。

凝胶渗透色谱分析条件，系统：Eco SEC-Work Station；色谱柱：PL gel MIXED-B（10 μm， 7.5×300 mm）；流动相：氯仿；流速：0.8 mL/min；柱温：40 ℃；检测器：示差折光检测器（RI）；进样量：样品溶液70 μL（2 mg/mL），标准溶液10 μL（1 mg/mL）；洗脱时间：30 min。

根据GPC标准曲线以及样品的保留时间，每一样品的数均分子量（Mn）、重均分子量（Mw）以及分子量分布指数（Mw / Mn）由仪器软件自动计算并输出。在Excel中绘制微分分子量分布曲线图。

1.3 数据处理

杜仲胶提取得率以及分子量分布等数据处理 每种实验方法重复3次，所得数据用SPSS 19.0软件（美国IBM）进行方差分析和Duncan多重分析。

2 结果与分析

2.1 材料预处理结果

杜仲果实去除种子，剥出果翅后，经充分研磨，可以见到白色胶丝外漏。用氢氧化钠碱性溶液沸水处理后，果翅的角质层、细胞壁的纤维溶解。随后采用索氏提取器进行乙醇处理后，叶绿素等醇溶性小分子物质分离，沉淀物从略带绿色逐渐转为白色。

2.2 杜仲胶提取纯化

利用甲苯、石油醚、氯仿作为有机溶剂，配合超声波处理组成6种不同的方法对预处理后的沉淀物进行溶解提取、干燥、精制，可得到杜仲胶精制品。根据提取得率的方差分析，3种有机溶剂对杜仲胶的提取得率有极显著影响（P=0.000 03<0.05），且有机溶剂与超声波处理之间有极显著的交互作用（P=0.000 89<0.05）。从各种方法的平均提取得率的差异性检验（图1）可以看出，采用氯仿作为有机溶剂（方法1和方法2）提取得率明显高于其他方法（平均提取得率分别达到7.48%和7.35%），此时是否配合超声波处理对提取得率的影响不大；采用石油醚作为有机溶剂（方法3和方法4）时，超声波处理能显著提高提取得率（平均提取得率分别为5.54%和6.68%），而采用甲苯作为有机溶剂（方法5和方法6）时，超声波处理反而会降低提取得率（平均提取得率分别为6.51%和5.44%）。

2.3 杜仲胶的分子量分布

利用凝胶渗透色谱仪对上述6种不同方法提取纯化的杜仲胶进行分子量分布分析。从各处理所得的杜仲胶微分分子量分布曲线（图2）可以看出，杜仲果翅中的杜仲胶为单峰分布的高分子聚合物，分子量分布介于104～107之间。从各处理所得的杜仲胶的数均分子量（Mn）、重均分子量（Mw）以及分子量分布指数（Mw / Mn）的情况（表1）可以看出，采用同一有机溶剂，未经过超声处理提取的杜仲胶的数均分子量明显大于超声处理的样品，而重均分子量则相反；经过超声处理的样品提取的杜仲胶的分子量分布指数明显大于未经超声处理的样品。采用氯仿作为有机溶剂配合超声波处理（方法2）提取的杜仲胶的分子量分布指数最大，达到9.99。

分子量分布指数是描述聚合物分子量的分布宽度或分散程度的指标。该数值大表明聚合物分子量的分散性大，即超声波处理所得杜仲胶的分子量分布范围较宽，部分小分子或大分子的胶也能得到充分提取。

3 讨论

综合杜仲胶提取得率以及分子量分布两个指标，本研究对杜仲胶分析测定方法进行了比较，结果表明，采用氯仿作为有机溶剂，配合超声波处理，在水浴下采用索氏提取杜仲胶的分析效果最佳，此方法的提取得率为7.48%，相比于之前报道的用石油醚提取杜仲翅果获得的5.47%[15]有较大进步。在提取过程中使用超声波辅助处理，可以进一步促进小分子或大分子杜仲胶聚合物的溶出，提取更加充分。这两个指标也是评价杜仲各种资源植株生产杜仲胶的数量和质量的重要依据，后者與杜仲胶的物理性能和使用性能密切相关[16]。

目前杜仲胶含量的分析测定主要采用碱液浸提法，溶剂浸提法，高温裂解法[17-19]等。碱液浸提法提取杜仲胶的效率较低；有机溶剂浸提法可以有效破坏细胞壁中的纤维素成分，但是不容易溶解果胶，影响胶丝分离；高温裂解法操作比较复杂，这些缺点都会降低杜仲胶的提取效率[17]。在本实验中采用综合方法对杜仲果翅进行杜仲胶的提取，首先在预处理中将果翅磨碎，初步暴露胶丝，然后用浓碱液蒸煮，降低角质层的阻碍作用，促进细胞壁的纤维分解降解，使得胶丝与果翅的其他杂质进一步分离。用无水乙醇处理去除果翅中的叶绿素等醇溶性小分子物质。最后利用低极性的有机溶剂氯仿对杜仲胶进行溶解、分离。同时在乙醇处理和氯仿提取的过程中，利用索氏提取器使溶剂蒸发后冷凝回流，达到重复浸提的效果，可以得到纯度较高的杜仲胶。

但是，笔者发现索氏提取超过6 h后，杜仲胶的提取得率反而略有减少，特别是分子量分布变窄（数据未显示）。该原因目前尚不清楚，可能与杜仲胶易于氧化有关。反式-1，4-聚异戊二烯橡胶分子结构的碳碳双键含量比较多，键能低，在热氧作用下比较活泼，容易发生断键反应，长时间的有机溶剂重复浸提可能破坏杜仲胶的分子链和结构[12，20]。有报道提出在索氏提取过程中，向冷却管充注氮气以防止杜仲胶的氧化[16]。

杜仲是第四纪冰川残留下来的孑遗植物，仅存于我国西北部分地区，是十分珍贵的天然资源。杜仲遗传变异丰富、适应性广泛，是唯一一种适合于亚热带、温带乃至寒带栽培的能够生产反式-天然橡胶的植物[2]。我国是世界上最大的天然橡胶消费国，但由于目前全世界的天然橡胶原料来源主要产自巴西橡胶树，受该树种热带生长特性限制，我国适合种植的区域有限，产能严重不足，目前对进口橡胶的依存度已高达80%，在不久的将来将严重制约我国橡胶工业的发展[8]。杜仲有望成为我国大部分地区能够栽培的、解决我国天然橡胶贫乏的工业瓶颈的新资源。本实验以杜仲胶的提取得率以及分子量分布为衡量标准，通过对杜仲材料预处理、杜仲胶提取方法进行比较，并利用凝胶渗透色谱仪进行分子量分布分析，确定了有效的杜仲胶分析测定方法。该研究对天然橡胶、特别是杜仲反式-1，4-聚异戊二烯橡胶的提取和分析具有参考价值，在杜仲资源的培育以及杜仲资源的综合开发利用的科研和生产实践中可用于测定杜仲植株或组织材料的反式-1，4-聚异戊二烯橡胶含量，判断育种效果、栽培措施等对反式-1，4-聚异戊二烯橡胶生物合成的影响等。

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