叶洲辰　吴友根　张军锋　胡新文　于靖　周开兵　林尤奋　王健　陈健妙

摘 要 采用噻唑蓝（MTT）法测定7种油茶籽油（茶油）及枯饼提取物的抗肿瘤活性，并通过福林-酚法和三氯化铝法对提取物中总酚和总黄酮的含量进行测定。结果表明，7种茶油中琼海茶油（炒）总酚（151.04 μg/g）和总黄酮（1.37 mg/g）含量最高，7种枯饼中总酚含量差异不显著，莆田枯饼（蒸）中总黄酮含量（5.55 mg/g）高于其他6种枯饼；7种茶油及枯饼提取物均具有明显的抗肿瘤活性，且在1～50 μg/mL的剂量范围内，对人肺癌细胞株（Lewis）、黑色素瘤细胞株（B16）及乳腺癌细胞株（SCC891）的增殖有不同程度的抑制作用，呈明显的剂量依赖关系。因此，开发利用油茶抗癌活性具有潜在的医用价值和经济效益。

关键词 油茶；总酚；总黄酮；抗肿瘤活性

中图分类号 R979.1 文献标识码 A

Abstract The anticancer activities of oils and cakes of Camellia spp. were detected by MTT in this paper. And the total phenolics and total flavonoids were measured by Folin-Ciocalteu reagent and aluminium chloride reagent， respectively. The results showed that the content of total phenolic（151.04 μg/g）and total flavonoid（1.37 mg/g）of the oil produced by stir-frying and squeezing from Qionghai exceeded those of the other samples. The total phenol content in seven cakes of Camellia spp. had no significant difference， and the total flavonoid content of the cake produced by steaming and squeezing from Putian was higher than other samples. The specific anticancer activities were clear from the oils and cakes of Camellia spp.. And their antiproliferative activities to lung cancer（Lewis）， melanoma（B16）and breast cancer（SCC891）cells in a range of concentrations from 1 to 50 μg/mL were increased in dose-dependent manner. Therefore， it had potential medical values and economic benefits to develop the anticancer effect of Camellia spp..

Key words Camellia spp.； total phenolics； total flavonoids； anticancer activities

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.07.007

油茶（Camellia spp.）隸属山茶科（Theaceae）山茶属（Camellia），是我国重要的木本油料作物，世界四大木本油料树种之一，具有较高的经济价值和生态效益[1]。油茶在中国有2300多年的栽培和利用历史，主要分布在我国的长江流域及其以南地区，资源非常丰富[2-3]。油茶籽经浸出或压榨即可得到茶油，是一种绿色、生态和高营养的保健油，是食用油中的珍品，富含不饱和脂肪酸、角鲨烯和生育酚等，具有清热化湿，杀虫解毒的功效，有“东方橄榄油”之称[4-5]；枯饼为茶籽榨油后的副产物，其利用率相对较低，现代研究发现，枯饼中富含茶皂素、黄酮、多糖及多酚等成分，具有减肥、降血糖、抑菌、消炎、抗衰老及预防癌症等功效，若能对枯饼加以有效利用，将大大提高油茶利用率并产生很高的经济效益[6-7]。

油茶在海南经过长期的引种驯化，产生了本地特有的栽培种[8]，其所产的茶油一般被当地居民用来治疗烧伤、烫伤、胃病及口腔溃疡等疾病。但目前关于该栽培种的研究报道较少，特别是抗肿瘤活性。因此，笔者通过体外观察海南琼海油茶及大陆其他优良品种油茶的茶油及枯饼提取物对人肺癌细胞株（Lewis）、黑色素瘤细胞株（B16）和乳腺癌细胞株（SCC891）增殖的影响，旨在为评价茶油药用价值提供理论依据，并为发掘枯饼等油茶副产品的新用途奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 实验所用油茶果分别采自海南琼海、广西岑溪、江西宜春、福建莆田和湖南岳阳5个市区，每个市区选择3个具有代表性且种植面积较大的采样点，选取长势、树龄以及果实大小比较一致的油茶树作为采样株，由海南大学杨好伟教授鉴定为Camellia spp.。采集时间为2015年10～12月，各市区混合样品均约为2.00 kg，经自然风干，脱蒲，去壳后，将油茶籽烘干至恒重（60 ℃，48 h），统一在琼海白石山榨油厂进行加工处理。其中琼海油茶与岑溪油茶分别采用炒制—压榨法和热蒸—压榨法两种加工方法各得两种不同的茶油及茶枯饼，而宜春油茶、岳阳油茶、莆田油茶的加工工艺统一为热蒸—压榨法，样品来源及加工工艺见表1。热蒸—压榨工艺和炒制—压榨工艺是目前加工厂或作坊较为常用的生产食用油的方法，也是市场所销售茶油的主要加工工艺，具有一定代表性。

1.1.2 细胞株 人肺癌细胞株（Lewis）、黑色素瘤细胞株（B16）以及乳腺癌细胞株（SCC891）由中国药科大学酶工程实验室提供，5% CO2，37 ℃恒湿条件下培养。

1.1.3 药物与试剂 刀豆蛋白（美国Sigma公司），四噻唑蓝（MTT，美国Sigma公司），RPMI-1640细胞培养基（美国Gibco公司），台盼蓝染色液（美国Beckman coulter公司），二甲基亚枫（DMSO，上海阿拉丁生化科技有限公司），福林-酚（上海阿拉丁生化科技有限公司），没食子酸标准品和芦丁标准品（成都Herbpurify有限公司），乙醇，三氯甲烷，乙酸乙酯，碳酸钠，亚硝酸钠和硝酸铝（分析纯，南京化学试剂有限公司）。

1.1.4 主要仪器和设备 细胞培养瓶，96孔细胞培养板和二氧化碳培养箱（美国Thermo Scientific公司），Bio-Rad 550型酶标仪（美国Bio-Rad公司），GL-21M高速冷冻离心机（湘仪离心机有限公司），冷冻干燥机（北京松源华兴科技有限公司），超声波清洗机（北京六一仪器厂），BS214S电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司），真空干燥箱（上海实验仪器总厂），倒置相差显微镜（上海光学仪器有限公司），超净工作台（苏州净化设备有限公司），UV-2100紫外分光光度计（上海UNICO仪器有限公司），SI-T256涡旋振荡器（美国Scientific Industries公司）。

1.2 方法

1.2.1 茶油提取物的制备 在500 mL烧杯中按体积比为5 ∶ 1的比例加入氢氧化钾溶液和茶油样品，振荡反应20 min，静置10 min，待分层后弃去上层溶液，下层溶液经0.22 μm孔径滤膜过滤；滤液加入5倍体积的60%乙醇溶液，过滤；40 ℃水浴减压浓缩后，将浓缩液移入分液漏斗中，加入等体积的三氯甲烷，萃取2次；合并水层后用等体积乙酸乙酯萃取，收集萃取液，40 ℃水浴减压浓缩；将样品移入-50 ℃冷冻干燥机中冻干18 h，收集冻干粉末。

1.2.2 枯饼提取物的制备 在500 mL烧杯中按体积质量比为10 ∶ 1的比例加入60%乙醇溶液和枯饼粉末，40 ℃水浴下超声（功率500 W，间隔4 s，持续15 s，超声20 min，重复3次），三层纱布粗滤后，用8 μm孔径滤膜过滤，残渣按上述方法用5倍体积的60%乙醇溶液提取20 min，过滤；40 ℃水浴减压浓缩后，将浓缩液移入分液漏斗中，加入等体积三氯甲烷，萃取2次；合并水层后用等体积乙酸乙酯萃取，收集萃取液，40 ℃水浴减压浓缩；将样品移入-50 ℃冷冻干燥机中冻干18 h，收集冻干粉末。

所有的冻干粉药物均溶于RPMI-1640培养基配成母液，经0.22 μm孔径滤膜过滤后，在超净工作台内紫外照射20 min，备用。

1.2.3 总酚含量测定 采用福林-酚法，以没食子酸为标准品来测定油茶样品中的酚类化合物含量[9]。分别吸取3 mL待测样品液至25 mL容量瓶中，加入20 mL蒸馏水和1 mL福林-酚试剂，在涡旋振荡器上充分混匀，室温反应3 min后，再加入1 mL 20% Na2CO3溶液，50 ℃水浴反应30 min，于765 nm处测定吸光值。没食子酸标准曲线Y=0.188 1 X-0.009 4（R2=0.998 7），根據标准曲线方程计算总酚含量，实验重复3次，取平均值。

1.2.4 总黄酮含量测定 采用Gorinstein等[10]所描述的三氯化铝法测定黄酮含量。分别吸取3 mL待测样品液至具塞比色管中，用60%乙醇溶液补足体积至5 mL，在涡旋振荡器上充分混匀后各加入0.3 mL 5% NaNO2溶液，混匀后静置5 min，加入0.3 mL 10% Al（NO3）3溶液，混匀后静置6 min，最后加入4 mL 1 mol/L NaOH溶液和0.4 mL 30%乙醇溶液使总体积为10 mL，混匀后静置10 min，在波长510 nm处测定吸光值。芦丁标准曲线Y=0.010 4 X + 0.020 3（R2=0.998 5），根据标准曲线方程计算总黄酮含量，实验重复3次，取平均值。

1.2.5 细胞培养 按药理实验[11]方法复苏细胞，常规传代培养。肺癌细胞（Lewis）、黑色素瘤（B16）及乳腺癌细胞株（SCC89）分别培养于含1 mg/mL刀豆蛋白的RPMI-1640培养液中，置于37 ℃，5% CO2及恒湿条件下细胞培养箱中培养。视具体情况，每2～3 d传代培养1次，使细胞保持在对数生长期，台盼蓝染色计数，调整细胞浓度为5×106个/mL，最后，取状态良好，增殖旺盛的细胞用于本实验。

1.2.6 噻唑蓝（MTT）法测定细胞的抑制率及IC50值 将处于对数生长期的细胞制成细胞悬液，以细胞密度1×104个/孔100 μL接种于96孔细胞培养板中，于37 ℃，5% CO2及恒湿培养箱中培养24 h，待细胞完全贴壁后，吸去原有培养液，加入油茶各提取物，使肿瘤细胞（Lewis、B16及SCC89）悬液中茶油和枯饼提取物的终浓度都分别为50、40、20、15、10、5、2和1 μg/mL，每组3复孔，以RPMI-1640培养基为本底对照组。各提取物与细胞在含37 ℃、5% CO2条件下共同孵育24 h后，于每孔中加入MTT溶液（5 mg/mL）20 μL，继续培养4 h后，2 500 r/min离心10 min，弃去上清液，加入100% DMSO溶液100 μL，经涡旋振荡器振荡10 min，待每孔中甲瓒结晶完全溶解后，用空白孔调零，在酶标仪波长570 nm处测定各孔吸光度（OD）。实验重复3次，计算细胞存活率和IC50值。

抑制率=（1-OD实验/OD对照）×100%

1.3 数据处理与分析

采用SPSS 19.0进行统计分析，各组数据以x±s表示。样品比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），再用LSD检验进行两两组间比较。p< 0.05有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 茶油及枯饼提取物总酚、总黄酮含量

茶油提取物中总酚和总黄酮的含量见表2，结果显示各组分两两之间差异显著（p<0.05），总酚含量高低依次为琼海（炒）>岳阳（蒸）>宜春（蒸）>岑溪（炒）>莆田（蒸）>岑溪（蒸）>琼海（蒸）；总黄酮含量高低依次为琼海（炒）>岳阳（蒸）>宜春（蒸）>岑溪（炒）>岑溪（蒸）>莆田（蒸）>琼海（蒸）。其中，琼海茶油（炒）中总酚及总黄酮含量显著高于琼海茶油（蒸），而岑溪茶油（炒）也略高于岑溪茶油（蒸），可推测加工工艺对茶油总酚及总黄酮含量影响较大，且炒制加工方法优于热蒸加工方法。琼海茶油（炒）中总酚及总黄酮含量显著高于其他6种茶油，原因可能是植物活性成分含量会受到产区环境条件的影响。

枯饼提取物中总酚和总黄酮的含量见表3，结果显示各组分两两之间差异显著（p<0.05），其中总酚含量最高的是琼海枯饼（炒）（6.10 mg/g），含量最低的是宜春枯饼（蒸）（2.66 mg/g）；而总黄酮在莆田枯饼（蒸）中含量（5.55 mg/g）显著高于琼海枯饼（蒸）（0.96 mg/g）。

2.2 茶油提取物体外对肿瘤细胞增殖的抑制作用

不同种茶油提取物对Lewis、B16及SCC891细胞增殖的影响见图1～3。结果表明，茶油提取物在1～50 μg/mL的剂量范围内，对Lewi、B16及SCC891细胞的增殖有不同程度的抑制作用，且呈明显的剂量依赖关系。不同种茶油提取物抑制Lewis、B16及SCC891细胞增殖的IC50值见表4，其中岑溪茶油（蒸）对Lewis细胞抑制作用的IC50值最低为75.56 μg/mL，可见岑溪茶油（蒸）对该肿瘤细胞的抑制能力最强；莆田茶油（蒸）抑制B16细胞增殖的IC50值最低（114.35 μg/mL），显著低于岳阳茶油（蒸）IC50值（316.77 μg/mL），可见莆田茶油（蒸）对B16细胞增殖的影响最大，而岳阳茶油（蒸）对该肿瘤细胞的抑制能力较弱；7种茶油对SCC891细胞抑制能力的IC50值大小顺序为岑溪（炒）>琼海（炒）>琼海（蒸）>莆田（蒸）>岳阳（蒸）>岑溪（蒸）>宜春（蒸），宜春茶油（蒸）对SCC891细胞抑制作用最强，其IC50值为98.96 μg/mL，显著低于其他6种茶油。

2.3 枯饼提取物体外对肿瘤细胞增殖的抑制作用

不同种枯饼提取物对Lewis、B16及SCC891细胞增殖的影响见图4～6，结果表明，1～50 μg/mL枯饼提取物对Lewis、B16及SCC891 3种肿瘤细胞的增殖均具有抑制作用，且隨提取物浓度升高对细胞的抑制作用增加。与对照组相比较，各给药组细胞存活率显著降低（p<0.05），可见枯饼提取物能抑制Lewis、B16及SCC891肿瘤细胞的增殖，且呈浓度依赖性。不同种枯饼提取物对Lewis、B16及SCC891细胞抑制能力的IC50值见表5，其中岳阳枯饼（蒸）对Lewis肿瘤细胞的抑制能力最弱，其IC50值为131.28 μg/mL，其余6种枯饼对该肿瘤细胞抑制作用均较强，莆田枯饼（蒸）对Lewis肿瘤细胞增殖的影响最大，IC50值56.55 μg/mL；岑溪枯饼（炒）表现出对B16肿瘤细胞较强的抑制作用，IC50值为68.31 μg/mL，而琼海枯饼（炒）抑制B16肿瘤细胞增殖的IC50值为275.97 μg/mL，差异十分显著；7种枯饼对SCC891肿瘤细胞增殖的抑制能力相当。

2.4 油茶提取物体中活性成分含量与其抗肿瘤活性的相关性分析

茶油及枯饼提取物中总酚和总黄酮含量与抗肿瘤活性的相关性分析见表6和表7，结果表明，茶油提取物中总酚的含量与对Lewis细胞的抑制能力呈极显著正相关，而总黄酮含量与对Lewis和B16细胞的抑制能力呈极显著正相关；枯饼提取物中总酚含量与对B16细胞的抑制能力呈极显著正相关，而总黄酮含量与对SCC891细胞的抑制能力呈极显著正相关，且相关系数可达0.858。由此可见，总酚和总黄酮等活性物质是油茶提取物抗肿瘤活性能力的主要成分，在生物体系中相关性明显，但茶油提取物和枯饼提取物中同一活性成分与对相同肿瘤细胞抑制作用的相关性程度不同，原因可能是茶油与枯饼中相同活性物质的组成成分不同，因而其活性能力存在差异。因此，在今后的研究中，不能仅局限于评价化合物体外抗肿瘤效果，还应该对其化学结构、抗肿瘤机理以及多组分协同作用等进行深入探讨，确切抗肿瘤活性还有待在动物水平上做进一步研究，这将有利于天然药物的开发和利用，并为先导化合物的发现以及天然化学物质的结构修饰和合成提供理论依据。

3 讨论

恶性肿瘤是机体在各种致癌因子作用下，局部组织细胞增生所形成的新生物，其普遍性与危害性严重危及人们的健康和生命，是当今世界最大的医学难题之一[12]。目前对肿瘤的各种治疗方法和手段尚不能从根本上杜绝肿瘤，切除手术又难以避免恶性肿瘤的转移扩散，且大部分抗肿瘤化学药物在杀死肿瘤细胞的同时，也严重损伤了正常细胞，故从传统植物中药资源中开发高效低毒的抗肿瘤药物已成为当今研究的一个热点[13]。

本文综合分析了茶油及枯饼提取物对多种肿瘤细胞增殖的抑制作用，结果表明，琼海茶油（炒）中总酚含量为151.035 μg/g，总黄酮含量为1.369 mg/g，显著高于其他茶油，尤其是琼海茶油（蒸），而岑溪茶油（炒）也略高于岑溪茶油（蒸），故推测加工工艺对茶油中总酚和总黄酮的含量存在一定的影响。周晴芬等[14]对4种茶油的总酚含量进行测定，结果表明毛油中的多酚含量高于精炼油。吕杰[15]认为活性物质在从油茶籽到油脂的转移过程中会发生损失，且其程度与加工工艺有关。此外，总酚和总黄酮的含量在岳阳茶油（蒸）、宜春茶油（蒸）、莆田茶油（蒸）、岑溪茶油（蒸）和琼海茶油（蒸）这5种茶油中均不相同，这说明相同加工技术，不同产区茶油间的总酚和总黄酮含量也存在差异，推测茶油中含有的活性成分也可能会受到环境气候，收获时间以及贮藏条件等的影响，这与Moghaddam等[16]的研究结论相一致。琼海枯饼（炒）中总酚含量（6.096 mg/g）也是7种枯饼中最高的，莆田枯饼（蒸）中的总黄酮含量（5.548 mg/g）显著高于琼海枯饼（蒸）（0.958 mg/g），可见同一产地品种在不同加工工艺条件下所得到的枯饼，其活性成分含量存在差异，且同种加工工艺下的不同产地油茶枯饼活性成分含量也不尽相同。曹耀强等[17]采用不同提取方法对油茶饼中酚类物质进行提取，结果差异较大。谢凤等[18]表明溶剂种类对所提酚类物质的种类和含量具有一定的影响，且不同品种的油茶多酚含量也存在一定的差异，这与本实验结论一致。

茶油及枯饼提取物在1～50 μg/mL的剂量范围内，对Lewi、B16及SCC891细胞的增殖有不同程度的抑制作用，呈明显的剂量依赖关系，这与淦永鉴等[19]所得出的结果相一致。7种茶油中，岑溪茶油（炒）对Lewis细胞增殖的抑制能力最强，莆田茶油（蒸）对B16细胞的影响最大，而宜春茶油（蒸）对SCC891细胞增殖的抑制率显著高于其他6种茶油；相对应的7种枯饼中，莆田枯饼（蒸）对Lewis细胞的增殖有明显的抑制作用，岑溪枯饼（炒）抑制B16细胞增殖的IC50值最小，7种枯饼对SCC891细胞增殖的抑制作用能力均较弱。另外，茶油及枯饼提取物中总酚、总黄酮含量与抗肿瘤活性间相关性明显，故推测茶油抗肿瘤活性能力的强弱可能主要取决于其所含有的次生代谢产物，但究竟哪些活性物质对肿瘤细胞的抑制效果最好，及其作用机理仍须进一步研究与探讨。唐玲等[20]测得油茶籽醇提取物对人体乳腺癌细胞（MCF-7）的IC50值低于油茶籽水提取物的IC50值，推测不同提取剂所得到的提取物活性成分含量及组成存在差异。马丽媛等[21]测得油茶粕提取物对人肺癌细胞（A549）和人乳腺癌细胞（MCF-7）的IC50值分别为77.56 μg/mL和81.51 μg/mL，且提取物的主要成分为皂苷。Kweon等[22]研究表明多酚类物质对多种肿瘤细胞能够发挥其抑制肿瘤和诱导细胞凋亡的作用。Lu等[23]发现黄酮类化合物具有潜在的抑制人体肺癌肿瘤细胞（A549）生长的潜力。因此可推测皂苷类、多酚类及黄酮类成分在枯饼的抗肿瘤疗效中发挥着重要作用，且活性成分之间相互协同或者拮抗作用可能也会对肿瘤细胞的增殖造成一定的影响。

海南琼海油茶与大陆其他优良品系油茶提取物的抗肿瘤活性能力相当，故此栽培种具有一定的推广价值[24]。整体而言，茶油及枯饼提取物有明显的抗肿瘤活性，且其总酚、总黄酮的含量与抗肿瘤活性存在一定的相关性。因此，油茶可作为潜在的天然抗肿瘤药物来源，应用于食品或医药行业。

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