曾宇　夏秀忠　农保选　张宗琼　杨行海　邓国富　刘开强　黄志　李丹婷

摘要：[目的]鉴定广西地方香稻品种的香味及其香味基因型，为开发和利用广西香稻地方种质资源及选育优质特色香稻品种提供理论依据。[方法]将传统香味鉴定方法（KOH浸泡法和籽粒咀嚼法）与分子标记技术结合，对179份广西地方香稻种质资源的香味及其香味基因型进行鉴定。[结果]179份供试材料中，KOH浸泡法检测到具有香味的材料167份，籽粒咀嚼法检测到具有香味的材料124份。籽粒咀嚼法鉴定为香稻的品种中97.58%能用KOH浸泡法鉴定出香味，但KOH浸泡法鉴定为香稻的品种中仅72.46%能用籽粒咀嚼法鉴定出香味。利用分子标记法能检测到等位基因的有7l份，占供试材料总数的39.66%，主要以InDe17和InDel4-5等位基因为主，其中仅1份检测到InDel2等位基因，40份检测到InDel7等位基因，37份检测到InDel4-5等位基因，未检测到InDel13等位基因，但有7份同时检测到In-Del7等位基因和InDel4-5等位基因。7l份能检测到等位基因的材料中有69份被籽粒咀嚼法和/或KOH浸泡法鉴定为香稻品种，正确率达97.18%。在籽粒咀嚼法和KOH浸泡法均鉴定为香稻的121个品种中，香味表型明确，但仅有55个品种能检测到等位基因，检出率为45.45%。來自百色市的供试材料中能检测到等位基因的品种占该市香稻品种总数的53.19%，含有InDel2、InDe17和InDel4-5等位基因型，但以Inde17等位基因型为主；来自河池市的供试材料中能检测到等位基因品种占该市香稻品种总数的比例最高，达64.10%，但只检测到2种基因型，以Indel4-5等位基因型为主；柳州市及其他市能检测到等位基因的比例远低于百色市和河池市。[结论]广西香稻地方品种具有较强的地域特色，不同地区的香稻香味等位基因存在明显差异，且可能存在已报道的等位基因之外的香味基因或香味等位基因，仅用4个已报道的等位基因不足以检测出全部的香稻品种，应将分子标记法与传统鉴定方法相结合，才可更准确鉴定出香稻品种。

关键词：香稻；香味；Badh2基因；等位基因；分子标记

0引言

[研究意义]香稻是一种具有独特香味的功能稻和特种稻，其食味佳且药效显著，在我国古代就享有“贡米”之称，国际市场价格是非香稻和优质稻的2-3倍（胡培松等，2006）。近年来，随着人们生活水平的提高，香稻市场需求量日益增大，迫切需要选育出更多优质香稻新品种，但鉴定其香味性状，明确香味产生的原因是发掘香味基因资源的首要工作，对选育优质特色香稻品种具有重要意义。[前人研究进展]自Ahn等（1992）采用分子标记技术将香稻的香味基因定位于第8染色体上以来，随着基因组学的发展，成功克隆香稻第8染色体上的香味基因（Bradbury et al.，2005），并发现香稻的香味主要受第8染色体上的甜菜碱醛脱氢酶（BADH2）基因Badh2控制（Chenet al.，2008），且其整个基因序列的引物也已设计完成（Shi et al.，2008），为深入研究香味基因打下基础。近年来，关于水稻香味基因的研究较多。Bradbury等（2005）研究发现，香稻香味的产生是由于第8染色体上的Badh2基因序列编码区第7外显子8 bp的缺失和3 bp突变造成编码蛋白的提前终止，产生无功能的截短BADH2蛋白，香味物质2-乙酰-1-吡咯啉（2-AP）不断积累，致使香稻的叶片和籽粒产生香味。Shi等（2008）研究发现，与非香稻品种相比，香稻的香味基因Badh2具有新等位基因，即第7个外显子正常而第2个外显子存在7 bp的缺失。王军等（2008）将Badh2基因第2个外显子的7 bp缺失和第7个外显子的8 bp缺失设计成lnDel功能性分子标记，分别命名为InDel-E2和InDel-E7，是最先应用于香稻基因缺失类型鉴定的功能性分子标记。Shao等（2011）研究发现，广西的香稻品种妙香糯第4、5外显子803 bp缺失。Myint等（2012）研究表明，缅甸的香稻品种Pathein Nyunt和Yangon Saba Badh2基因第13外显子中插入3 bp，导致稻米产生香味，是一种新的等位基因型，由此开发了相应功能性分子标记In-Del-E5和InDel-E13。这些InDel功能性分子标记的开发，为香稻种质资源的鉴定筛选及多样化研究提供了便利，使更多香稻的香味基因型得以鉴定（Fitzgerald et al.，2008；刘化龙等，2014；闫影等，2015）。目前，已将香味基因功能性分子标记应用到香稻定向选育，以提高选育效率和准确性。杜雪树等（2009）利用香味基因功能性分子标记成功选育出香稻恢复系C349和c354。董华林等（2015）利用香味基因功能性分子标记定向选择亲本，选育出可媲美泰国香稻的优质香稻Y43。赵志鹏等（2015）利用香味基因功能性分子标记辅助选育优质、高产香型粳稻种质纯合株系香粳1305。[本研究切入点]广西独特的气候条件和区位优势，造就了丰富的稻种资源，存在一些以香、糯、大、软、白为特点的特色香稻地方品种，具代表性的有靖西香糯、上思香糯、都安板升香糯等，在我国享有盛名，是非常宝贵的地方稻种资源，但有关广西香稻种质资源的香味性状及香味基因研究鲜见报道。[拟解决的关键问题]将分子标记技术与传统鉴定方法相结合，对广西不同地方香稻品种的香味性状进行鉴定，明确其香味基因型及存在的多样化信息，为挖掘新香味基因资源，发挥广西香稻优势，培育优质特色水稻品种打下基础，同时为开展广西区稻种资源的原位保护提供理论依据。

1材料与方法

1.1供试材料

供试的179份香稻材料分别来自广西不同地区（表1），收集于20世纪70-90年代，保存于广西农业科学院中期库，原记录信息为香稻。其中，糯稻175份，粘稻4份；粳稻176份，籼稻3份；水稻176份，陆稻3份。所有供试材料均种植于广西农业科学院水稻研究所试验田，于2013年7月25日播种，8月5日移栽，9月中旬分蘖，11月中旬收获。

1.2试验方法

1.2.1传统方法鉴定香稻香味 采用2种传统方法进行香味鉴定。（1）KOH浸泡法：在水稻分蘖期，取每份材料的单株叶片2 g，剪碎后放人50 mL离心管中，加入10 mL 1.7%KOH溶液，加盖密封后于30℃放置10 min，然后逐一打开盖子，立即闻其气味，评价有无香味。为避免嗅觉差异引起偏差，每次检测均设香稻材料和非香稻材料为对照。采用3人分别评定的方法，并对有争议的材料进行重复鉴定（Sood and Siddiq，1978）。（2）籽粒咀嚼法：稻米成熟后分别收集每份材料的单株谷粒，自然晒干后每株随机选取一个穗子的16粒谷粒，剥壳逐粒咀嚼糙米，鉴定其香味。若16粒均不香，表明该植株种子无香味，鉴定为非香稻品种；若连续5粒谷粒均有香味，鉴定为香稻品种。采用3人分别评定的方法，并对有争议的材料进行重复鉴定（Bemer and Hoff，1986）。

1.2.2分子标记法鉴定香稻香味基因型

1.2.2.1引物设计 目前已报道的Badh2基因有4个等位基因，其中InDel2等位基因为第2外显子7 bp缺失，InDel7等位基因为第7外显子8 bp缺失和3 bp突变，lnDel4-5等位基因为第4-5外显子803 bp缺失，lnDell3等位基因为第13外显子3 bp插入。4个等位基因引物见表2，由广州英韦创建生物科技有限公司合成。4个等位基因的非香型对照均为日本晴，其中，lnDel2、InDel7和InDel4-5的香型对照品种分别为武香粳9号、广陵香糯和花香糯，InDell3无香型对照品种。

1.2.2.2总DNA提取 参照Murray和Thompson（1980）的CTAB法提取每份材料单株叶片的总DNA。

1.2.2.3 PCR扩增及基因型鉴定 PCR扩增参照Shao等（2011）的方法。PCR产物用8%垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，经0.2%硝酸银快速染色并观察拍照。根据PCR产物长度判断香稻材料的香味基因型，纯合香味基因型记为1，杂合香味基因型记为2，非香基因型记为0，并统计各基因型数量。

2结果与分析

2.1香稻香味的鉴定结果

179份供试材料的品种信息中显示为香稻，但部分仅是资源收集时的简单记录，未经过严格的香味鉴定。本研究利用籽粒咀嚼法和KOH浸泡法验证这批材料是否具有香味。籽粒咀嚼法和KOH浸泡法均可快速鉴别香稻的香味，但检测结果存在差异（表3）。KOH浸泡法检测到具有香味的材料167份，占供试材料总数的93.30%；籽粒咀嚼法检测到具有香味的材料124份，占供试材料总数的69.27%，两种方法均能检测到香味的材料121份，占供试材料总数的67.60%，两种方法（籽粒咀嚼法和/或KOH浸泡法）共检测到有香味的材料共170份。综上所述，籽粒咀嚼法鉴定为香稻的品种中97.58%能用KOH浸泡法鉴定出香味，但KOH浸泡法鉴定为香稻的品种中仅72.46%能用籽粒咀嚼法鉴定出香味，表明KOH浸泡法能鉴定出较多的香味品种。

2.2香味基因型鉴定结果

利用分子标记法鉴定广西香稻地方品种香味基因型，结果如表4所示，有71个品种能检测到香味等位基因，占供试材料总数的39.66%，其中仅1个品种检测到InDel2等位基因，40个品种检测到InDel7等位基因，37个品种检测到InDel4-5等位基因，但有7个品种同时检测到InDel7等位基因和InDel4-5等位基因，即纯InDel7等位基因型的香稻品种33个、纯InDel4-5等位基因型的香稻品种30个；供试的179个香稻地方品种均未检测到InDell3等位基因。部分供试香稻材料的分子标记检测结果如图1所示。糯稻尾为InDel2等位基因型，号石蛇和香糯为InDel7等位基因型，冷水糯、后糯八谷和黑米糯为InDel4-5等位基因型，八月糯为InDel7和InDel4-5等位基因型，但在黑皮糯谷、谷对实、后十亮列、禾糯大坡和靖西香谷中4个等位基因均未检测到。

综上所述，供试的179份地方水稻材料中，主要1）.2InDel7等位基因型和InDel4-5等位基因型为主，分别占71份检测到已知等位基因品种数的46.48%和42.25%，分别占两种传统方法（籽粒咀嚼法和/或KOH浸泡法）鉴定为香稻品种数（170份）的19.41%和17.65%。如表3所示，KOH浸泡法鉴定为香稻的167个品种中能检测到等位基因的有67个，占40.12%。籽粒咀嚼法鉴定为香稻的124个品种中能检测到等位基因的有57个，占45.97%。KOH浸泡法和籽粒咀嚼法均鉴定为香稻的121个品种中能检测到等位基因的有55份，占45.45%。表明利用分子标记法能检测到等位基因的71个品种中，有69个被籽粒咀嚼法和/或KOH浸泡法鉴定为香稻品种，正确率达97.18%。但仅用4个已知的等位基因不足以检测出全部的香稻品种，在籽粒咀嚼法和KOH浸泡法均鉴定为香稻的121个品种中，香味表型很明确，但仅有55个品种能检测到等位基因，检出率为45.45%。由此推测，供试的香稻品种中含有其他未知的香味基因或香味等位基因。

2.3香味等位基因地域分布分析

广西的香稻品种以粳糯稻为主，主要分布于百色、河池和柳州等市的山区。本研究供试香稻品种中有140个来自于这3个市，占供试材料总数的78.21%，其余21.79%的供試材料分别来自于崇左、来宾、桂林、防城港、南宁和钦州6个市（表1）。各市的香稻品种香味基因型存在明显差异（表5）。来自百色市的供试材料中被鉴定为香稻的品种数量（籽粒咀嚼法和/或KOH浸泡法）占供试材料总数的比例最低，为87.04%，其中能检测到等位基因的品种有25个，占该市香稻品种总数的53.19%，具有本研究能检测到的全部等位基因型即InDel2、InDel7和InDel4-5，基因型丰富，但以Indel7等位基因型为主，占该市能检测到等位基因品种数的60.00%。来自河池市的供试材料中，能检测到等位基因的品种数占该市香稻品种总数比例最高，达64.10%，但仅检测到2种等位基因，以Indel4-5等位基因为主，占该市能检测到等位基因品种数的64.00%。柳州市及其他市全部供试品种均鉴定为香稻品种，但能检测到等位基因的比例却远低于百色市和河池市。

3讨论

已有研究表明，KOH浸泡法和籽粒咀嚼法是常用的传统香味鉴定方法，仅用其一即可鉴定出香稻品种（叶兴锋等，2013）。但本研究发现，用叶片KOH浸泡法比籽粒咀嚼法能鉴定出更多的香稻品种，在籽粒咀嚼法鉴定为香稻的品种中，97.58%同样被KOH浸泡法鉴定为香稻品种；在KOH浸泡法鉴定为香稻的品种中，仅72.46%被籽粒咀嚼法鉴定为香稻品种。由于香稻籽粒是最主要的目标，故可用籽粒咀嚼法进一步验证KOH浸泡法。结合两种方法进行香味鉴定，可获得更准确的香稻品种鉴定结果。随着分子标记技术的发展，根据水稻Badh2基因的等位基因设计InDel分子标记用于鉴定香稻品种，具有准确性高、实用性强和操作简单等特点（徐小龙等，2011；张江丽等，2015），是定向选育香稻品种的有效、快捷途径（董华林等，2015；赵志鹏等，2015）。本研究还发现，利用已报道的Badh2基因4个等位基因（InDel2、InDel7、InDel4-5和InDell3）来鉴定香稻品种的准确率高达97.18%，但仅用4个等位基因不足以检测出所有香稻品种，在籽粒咀嚼法和KOH浸泡法均鉴定为香稻的品种中，仅45.45%的香稻品种能检测到等位基因，说明在供试香稻材料中含有其他香味基因或香味等位基因，可通过对香味基因Badh2进行测序、基因定位和基因克隆等研究进一步挖掘。

本研究的179份供试香稻材料中有香味材料170份（籽粒咀嚼法和/或KOH浸泡法），19.41%为InDel7等位基因型，17.65%为InDel4—5等位基因型，仅0.59%为InDel2等位基因型，无InDell3等位基因型，其中7个香稻品种同时存在2个香味等位基因（InDel7和InDel4-5等位基因型），表明其Badh2基因既存在第7外显子8 bp缺失和3 bp突变又存在第4-5外显子803 bp缺失，属叠加型的缺失类型。这与Shao等（2011）、Myint等（2012）、姜达等（2015）研究证实，香稻香味仅受Badh2基因单一缺失或突变型控制的结论相矛盾，其原因可能是在种植过程品种发生自然或人工杂交，聚合了2个香稻品种的等位基因，也有可能是品种在进化过程中，Badh2基因多个位置同时发生突变。

广西香稻地方品种具有较强的地域特色，不同地区的香稻香味等位基因存在明显差异。本研究供试香稻地方品种中78.21%来自百色、河池和柳州等3个市。这3个市分别位于广西的西北部和中北部，有较多少数民族聚居的山区，当地人喜食糯米，香糯稻是重要的饮食和宗教材料，因此香糯稻地方品种非常丰富，是香稻宝贵的基因资源。由于山区的香糯稻品种部分种于山坡或丘陵地，抗旱和耐贫瘠能力强，因此，这些地方品种在优异基因挖掘及香稻和糯稻新品种选育中具有重要的应用价值。此外，粳糯在广西又称大糯，米粒圆润，粘性好，做粽子、糍粑等商品性好，如三江大糯、大順糯米等，深受消费者喜爱，但当前一些粳糯稻老品种综合性状差、产量低，可利用本研究鉴定筛选出的香型粳糯稻进行遗传改良，选育出高产、综合性状好、适应性广的粳型香糯。

4结论

广西香稻地方品种可能存在已报道的香味等位基因之外的香味基因或香味等位基因，且不同地区的香稻其香味等位基因存在明显差异，可进一步挖掘广西特色香味基因型，并应用于育种研究。