吕松琴，黄山，李晓非，资敏，张娟，施金丽(昆明市第三人民医院检验科，昆明 650041)

·调查研究·

昆明地区健康成年人外周血T淋巴细胞亚群参考区间调查*

吕松琴，黄山，李晓非，资敏，张娟，施金丽
(昆明市第三人民医院检验科，昆明 650041)

目的 建立昆明地区健康成年人的T淋巴细胞亚群参考区间。方法 用流式细胞术检测昆明地区1 180例健康成年人外周血T淋巴细胞亚群并分析结果。结果 昆明市不同城区健康成年人外周血T淋巴细胞亚群分布差异无统计学意义(P>0.05)。女性的CD3+/淋巴细胞(68.6±8.0)%、CD3+CD4+/淋巴细胞(36.6±6.8)%均高于男性CD3+/淋巴细胞(65.4±9.6)%、CD3+CD4+/淋巴细胞(33.8±7.8)%，差异有统计学意义(P=0.000)。各年龄组间除CD3+CD4+计数差异无统计学意义(P>0.05)外，其余6项T淋巴细胞亚群差异有统计学意义(P=0.000)；青年组CD3+、CD3+CD8+、CD3+/淋巴细胞高于中年组和老年组，差异有统计学意义(P<0.05)，但年龄的变化与CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3+/淋巴细胞、CD3+CD4+/淋巴细胞、CD3+CD8+/淋巴细胞、CD4+/CD8+的相关性均无统计学意义(r=-0.173、0.206、0.154、0.219、0.02、0.077、0.234，P=0.000)。按性别或年龄段分别制定了相应的参考区间。结论 建立了昆明地区健康成年人外周血T淋巴细胞亚群参考区间，为今后云南省艾滋病及相关疾病的诊断、治疗以及疗效评价提供依据。

流式细胞术；T淋巴细胞亚群；参考区间

T淋巴细胞亚群分析是检测细胞免疫和体液免疫功能的重要指标，能客观反映机体当前的免疫功能和平衡水平，在自身免疫病、恶性肿瘤、病毒感染、免疫缺陷以及移植免疫等疾病的辅助诊断、发病机制分析、疗效观察及预后判断方面具有重要的意义。国内外学者研究证明，T淋巴细胞亚群分布受生态环境、社会经济等多种因素影响，不同地域、种族和性别间存在差异[1-2]。目前国内尚无统一的T淋巴细胞亚群参考值，昆明地区也无相应的调查研究。本研究拟建立昆明地区健康成年人外周血T淋巴细胞亚群参考区间，报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2016年6至12月到云南省第二人民医院体检中心进行单位体检的健康成年人1 180例，均为昆明市四城区常住人口，官渡区295例、西山区295例、盘龙区295例、五华区295例；男性687名，女性493名；年龄(44.6±15.0)岁。根据中华人民共和国卫生和计划生育委员会分类方法(18～44岁为青年组，45～64岁为中年组，≥65岁为老年组)，青年组667例，中年组378例，老年组135例。参考人群必须符合如下条件：(1)无现病史，无吸烟史，没有任何影响检测结果的生理指征；(2)未使用过对免疫系统有影响的药物；(3)实验室检查：血细胞计数正常，心、肝、肾功能(血清胆红素、乳酸脱氢酶、肌酸激酶、门冬氨酸氨基转移酶、丙氨酸氨基转移酶、尿素、尿酸、肌酐)检测正常；(4)无免疫系统疾病、血液系统疾病，无过敏现症，无HIV、HBV、HCV、梅毒和其他急性传染性疾病；(5)3个月内无输血和手术史；(6)妇女不在月经期、妊娠期或哺乳期；(7)无酗酒史。本研究经昆明市第三人民医院伦理委员会审核通过，研究前向参考个体讲述本研究的目的和实施方案，征得同意后并签署知情同意书。

1.2 主要仪器和试剂 单克隆荧光抗体CD45-FITC/CD4-PE/CD8-ECD/CD3-PC5、溶血素OptiLyse C、Flow-Count计数微球、Lymphosure质控品、稀释液、Flow-Check Fluorospheres流式细胞仪光路与流路校准物、Beckman NaviosTMFlow Cytometer流式细胞仪均购自美国Beckman Coulter公司。

1.3 流式细胞术检测外周血T淋巴细胞亚群 参考人群清晨空腹无菌采集静脉血4 mL，EDTA-K2抗凝,24 h内检测。取流式试管，用反向加样法加入100 μL抗凝全血；加入相对应的四色抗体10 μL，涡旋混匀，室温避光放置15～20 min；取出试管，每管加入500 μL OptiLyse C，涡旋混匀，室温避光放置10 min；取出试管，每管加入500 μL PBS，室温平衡5 min；取出Flow-Count荧光微球，涡旋震荡混匀10～12 s；以反向加样法在试管中加入100 μL荧光微球；充分涡旋混匀，2 h内上机检测。每次开机用Flow-Check Fluorospheres对流式细胞仪进行光路与流路校准，记录前向散射光(FS)和各荧光信号的半峰变异系数(HPCV)值，追踪一定时间内HPCV的变化，要求变异系数(CV)值控制在2%～3%，以确保仪器处于稳定状态，保证实验的一致性和稳定性。每天用Lymphosure质控品进行一次室内质控，操作与样本相同，以保证检测结果的可靠性。

2 结果

2.1 不同城区健康成年人外周血T淋巴细胞亚群检测结果比较 各组数据均符合正态分布，采用单因素方差分析比较昆明市四城区健康成年人外周血T淋巴细胞亚群显示，各城区CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3+/淋巴细胞、CD3+CD4+/淋巴细胞、CD3+CD8+/淋巴细胞、CD4+/CD8+之间差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 不同城区健康成年人T淋巴细胞亚群比较

2.2 不同性别健康成年人外周血T淋巴细胞亚群检测结果比较 男性、女性T淋巴细胞亚群数据均符合正态分布，不同性别CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3+CD8+/淋巴细胞、CD4+/CD8+之间差异无统计学意义(P>0.05)，但女性CD3+/淋巴细胞、CD3+CD4+/淋巴细胞均高于男性，差异有统计学意义(P=0.000)。见表2。

表2 不同性别健康成年人T淋巴细胞亚群比较

2.3 不同年龄组健康成年人外周血T淋巴细胞亚群检测结果比较 不同年龄组CD3+、CD3+CD4+亚群检测结果采用单因素方差分析，CD3+CD8+、CD3+/淋巴细胞、CD3+CD4+/淋巴细胞、CD3+CD8+/淋巴细胞、CD4+/CD8+方差差异有统计学意义，采用非参数Kruskal Wallis 检验，结果显示，各年龄组间除CD3+CD4+差异无统计学意义(P>0.05)外，其余6项T淋巴细胞亚群差异有统计学意义(P=0.000)，见表3。各年龄组间CD3+采用Tukey法进行多重比较，CD3+CD8+、CD3+/淋巴细胞、CD3+CD4+/淋巴细胞、CD3+CD8+/淋巴细胞、CD4+/CD8+采用Tamhane法进行多重比较，结果显示，青年组CD3+、CD3+CD8+、CD3+/淋巴细胞、CD3+CD8+/淋巴细胞高于中年组和老年组，差异有统计学意义(P<0.05)；中年组CD3+/淋巴细胞高于老年组，差异有统计学意义(P<0.05)；中年组与老年组之间CD3+、CD3+CD8+、CD3+CD8+/淋巴细胞差异无统计学意义(P>0.05)。老年组和中年组CD4+/CD8+高于青年组，差异有统计学意义(P<0.05)；中年和老年组差异无统计学意义(P>0.05)。中年组CD3+CD4+/淋巴细胞高于青年组和老年组，差异有统计学意义(P<0.05)；青年组和老年组间差异无统计学意义(P>0.05)。

由于不同年龄组之间T淋巴细胞亚群存在差异性，进行相关性分析，结果显示年龄与CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3+/淋巴细胞、CD3+CD4+/淋巴细胞、CD3+CD8+/淋巴细胞、CD4+/CD8+均无统计学相关性(r=-0.173、0.206、0.154、0.219、0.02、0.077、0.234，P=0.000)。

表3 不同年龄组健康成年人T淋巴细胞亚群比较

2.4 昆明市健康成年人外周血T淋巴细胞亚群参考区间建立 由于不同性别、不同年龄组T淋巴细胞亚群部分指标差异有统计学意义，因此按性别或年龄段分别制定相应的95%参考值范围。见表4。

表4 昆明市健康成年人外周血T淋巴细胞亚群参考区间

3 讨论

T细胞产生于胸腺，骨髓造血干细胞的T细胞前体在胸腺基质细胞和细胞因子的作用下，分化成有功能的T淋巴细胞，按其功能可分为3个亚群：辅助性T细胞、抑制性T细胞和细胞毒性T细胞。临床上很多免疫缺陷病、肿瘤、感染性疾病、自身免疫性疾病、器官移植、接受放疗或化疗、使用激素等均可出现T淋巴细胞数量及功能的变化[3]。

调查结果表明，T淋巴细胞亚群分布受地域、性别、年龄的影响[4]。本实验纳入的参考人群超过1 000例，覆盖了昆明市4个城区，可能由于生活环境、生活方式、饮食习惯相似，昆明市4个城区健康成年人T淋巴细胞亚群的分布差异无统计学意义。本实验中男女间CD3+、CD3+CD4+绝对数差异无统计学意义，这与云南德宏州傣族人的调查结果[5]相似，与贵阳、北京地区不同[6-7]；男女间CD3+CD8+绝对数差异无统计学意义，与云南德宏州傣族人、北京地区[5-6]等不同，但女性CD3+/淋巴细胞、CD3+CD4+/淋巴细胞均高于男性。

除CD3+CD4+绝对数差异无统计学意义外，各年龄组CD3+、CD3+CD8+、CD3+/淋巴细胞、CD3+CD4+/淋巴细胞、CD3+CD8+/淋巴细胞、CD4+/CD8+均存在差异，差异有统计学意义，这与苏宝珍等调查结果相似[5]。研究发现青年组CD3+、CD3+CD8+、CD3+/淋巴细胞、CD3+CD8+/淋巴细胞均高于中年组和老年组，青年组CD4+/CD8+低于老年组和中年组，差异有统计学意义。人体免疫功能随着年龄增长呈现一定的变化，中老年人随着年龄的增长，机体各种机能及物质代谢均有明显改变，T淋巴细胞功能也随之下降[8]，从而造成免疫系统平衡失调。同时研究发现CD3+、CD3+CD8+、CD3+/淋巴细胞、CD3+CD8+/淋巴细胞虽然不同年龄组间存在差异，但与年龄并无统计学相关性。

云南省是我国艾滋病高流行区之一，也是从2003年开始最早启动抗病毒治疗的省份之一。本研究建立昆明地区健康成年人外周血T淋巴细胞亚群参考区间，为今后预防、诊断AIDS、抗病毒治疗以及疗效评价提供更为有效、准确的科学依据。

本研究存在不足之处。首先，由于经费原因没有纳入未成年参考人群进行比较分析。第二，没有运用建立的昆明地区健康成年人外周血T淋巴细胞亚群参考区间与结核病、病毒性肝炎、艾滋病等相关疾病患者的T淋巴细胞亚群进行比较分析，我们将在后续的研究中，扩展参考区间的运用领域，体现其价值。

[1]Kayser G，Schuhe-Uentrop L，Sienel W，etal．Stromal CD4/CD25 positive T-cells are a strong and independent prognostic factor in non-small cell lung cancer patients，especially with adenocarcinomas[J]．Lung cancer，2012，76(3): 445-451．

[2]马新华．调节性T细胞与肿瘤研究进展[J]．国际妇产科学杂志，2011，38(2): 112-114．

[3]Lydyard PM，Whelan A, Fanger MW．免疫学[M]．林慰慈，译．北京：科学出版社，2010：34-35．

[4]梁君，陶钧，张辉，等. 我国部分省市及民族健康人T淋巴细胞亚群参考值范围的研究[J]．中国病毒病杂志，2013，3(2): 122-126．

[5]苏莹珍，俞守义，贾曼红，等. 傣族健康成人及青少年T淋巴细胞亚群正常值调查[J]. 中国组织工程研究与临床康复，2010, 14(44): 8237-8240.

[6]韩呈武，于雪莹，王丽娜，等. 北京地区健康成人外周血T淋巴细胞亚群的参考范围[J].临床检验杂志，2009，27(5)：390-392.

[7]叶艾竹，袁军，刘水和，等. 贵阳地区成人外周血淋巴细胞亚群及活化正常参考值[J].贵阳医学院学报，2010,35(1):68-70.

[8]郭楠, 单风平. 调节性T细胞在肿瘤及相关炎症中的研究进展[J]. 国际免疫学杂志，2016，39(3): 302-306.

(本文编辑：刘群)

昆明市科技计划项目(2016-2-S-06467)。

吕松琴，1975年生，女，副主任技师，大学本科，主要从事传染病免疫检验研究。

李晓非，主任技师,硕士,E-mail：lixiaofeicute@126.com。

10.13602/j.cnki.jcls.2017.04.21

R446.6

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2017-01-10)