费倩倩，丁家怡，施蔚红，金华，谭小方，陈小波(南通市妇幼保健院.生殖医学中心，.产前诊断中心，江苏南通 226000)

·临床实验研究·

原因不明复发性流产患者血清IL-33水平与TH1、TH2、TH17及Treg细胞间的关系*

费倩倩a，丁家怡a，施蔚红a，金华a，谭小方a，陈小波b
(南通市妇幼保健院a.生殖医学中心，b.产前诊断中心，江苏南通 226000)

目的 探讨IL-33和TH1、TH2、TH17及调节性T细胞(Treg细胞)在原因不明复发性流产(URSA)患者中的水平及其相关性。方法 收集46例URSA患者及40例健康人对照者，流式细胞术检测外周血TH1、TH2、TH17及Treg细胞比例；ELISA检测血清IL-33浓度。结果 与健康人对照组相比，URSA患者血清IL-33浓度显著下降，此外，外周血TH1和TH17细胞比例更高，而TH2和Treg细胞则低于健康人对照组(P<0.05)。IL-33浓度与TH1和TH17细胞比例均显著负相关，而与TH2细胞比例呈正相关性，但与Treg细胞间无显著相关性(P>0.05)。结论 URSA患者外周血IL-33浓度显著下调，并与TH1、TH2和TH17等免疫细胞比例相关，提示在URSA患者中IL-33可能与TH1、TH2和TH17存在关联。

原因不明复发性流产；白介素33；辅助T细胞；调节性T细胞

复发性流产(recurrent spontaneous abortion, RSA)是指连续两次以上在孕20周以前发生的自然流产，其发病率约为1%～3%[1]。其中原因不明复发性流产(unexplained recurrent spontaneous abortion, URSA)约占RSA患者的50%左右。目前研究表明URSA多与母胎免疫因素相关，免疫调控与抑制间失衡被认为是URSA的主要原因[2]。既往大量研究支持TH1/TH2失衡可能是URSA患者中主要的免疫系统变化，而新型T细胞亚群如TH17和调节性T细胞(Treg细胞)的出现改变了这一假说。Lee等[3]已经报道了TH17和Treg细胞间紊乱参与URSA致病的机理。IL-33为IL-1家族新成员，参与多种炎症性和自身免疫性疾病，且可通过调控TH1/TH2和TH17/Treg细胞平衡发挥生理作用[4]。据此，推测IL-33可能在URSA过程中发挥重要作用，但目前未见相关报道。本研究通过检测URSA患者血清IL-33水平，分析其与TH1、TH2、TH17和Treg细胞间的关联，探讨IL-33与URSA发病的关系。

1 材料和方法

1.1 研究对象 选取2015年2月至2016年5月于南通市妇幼保健院生殖医学中心就诊的URSA患者46例，符合URSA诊断标准[5]，即2次以上自然流产，病因经普通检查无法确定，且男方精液指数正常。排除染色体异常、激素水平紊乱、代谢性疾病、感染性疾病以及诸如抗磷脂抗体、狼疮抗凝物、抗核抗体、抗子宫内膜抗体及抗绒毛膜促性腺激素(HCG)抗体阳性的患者。URSA组年龄(32.61±3.59)岁，就诊时B超示胚胎停止发育，流产时孕周(8.1±0.9)周。选取同期在门诊要求人工流产的早孕女性40例作为对照组，B超示胚胎正常发育。对照组无自然流产史及自身免疫病和遗传病史，年龄(31.79±3.98)岁，行人工流产手术时孕周(7.9±1.3)周。两组间年龄、孕周差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2 试剂及仪器 Human IL-33 Quantikine ELISA Kit(R&D公司)；藻红蛋白-德克萨斯红(ECD)标记抗人CD3抗体、异硫氰酸荧光素(FITC)标记抗人CD4抗体、藻红蛋白-花青素5(PC5)标记抗人CD25抗体、藻红蛋白(PE)标记抗人IL-17抗体、藻红蛋白-花青素7(PC7)标记抗人CD45抗体、PE标记抗人IL-4抗体、PE标记抗人IFN-γ抗体(BD公司)；Ficoll淋巴细胞分离液(北京索宝公司)；Beckman FC500流式细胞仪(Beckman Coulter公司)。

1.3 标本采集 URSA组和对照组分别在流产术前抽取清晨空腹静脉血10 mL，分装4管。其中3管EDTA抗凝，与等体积PBS混匀后用Ficoll淋巴细胞分离液分离获取外周血单个核细胞(PBMC)，保存于含10%二甲基亚砜(DMSO)的胎牛血清中。另一管分装至干燥管，分离血清，-80 ℃保存。

1.4 血清IL-33浓度检测 血清IL-33浓度检测采用ELISA法，具体步骤和方法严格按照试剂盒说明书操作。

1.5 TH1、TH2及TH17细胞比例检测 用RPMI 1640调整PBMC浓度至2.0×106/mL，接种于6孔板中加入25 ng/mL佛波酯、500 ng/mL离子霉素及1.7 μg/mL莫能霉素，37 ℃ 5% CO2培养箱中培养4 h。加入荧光标记抗CD3和CD4抗体各10 μL，室温避光温育20 min，用PBS洗2次离心弃上清，固定剂固定15 min，PBS洗1次离心弃上清，加入破膜剂室温温育5 min离心弃上清。分别加抗IL-4、IFN-γ和IL-17抗体，室温避光温育20 min，离心弃上清，加入500 μL PBS悬浮后上机检测。圈定CD3+细胞群，分析TH1、TH2及TH17细胞群，表型分别为CD3+CD4+IFN-γ+、CD3+CD4+IL-4+和CD3+CD4+IL-17+。

1.6 Treg细胞比例检测 取EDTA抗凝血30 μL加入流式检测管，加入CD45、CD4和CD25抗体各3 μL，室温避光温育15 min，加300 μL红细胞裂解液混匀，室温避光10 min，离心弃上清；用PBS洗2次弃上清，加300 μL PBS重悬上机，根据CD45和SSC圈定淋巴细胞群，再对CD4+T淋巴细胞进行设门，圈定CD4+CD25highTreg细胞群。

2 结果

2.1 URSA患者血清IL-33浓度 URSA患者和对照组血清IL-33水平分别为(113.95±29.77) pg/mL和(146.35±21.08) pg/mL，差异有统计学意义(t=3.972，P<0.05)。

2.2 URSA患者外周血TH1、TH2、TH17、Treg细胞比例 流式细胞分析结果显示，URSA患者外周血TH1比例高于对照组，TH2细胞比例低于对照组，TH17细胞比例高于对照组，而Treg细胞比例显著低于对照组，差异均有统计学意义(P均<0.05)，见表1。流式图详见图1。

2.3 URSA患者血清IL-33水平与TH1、TH2、 TH17、Treg细胞比例间的相关性 Spearman相关分析发现，IL-33与TH1和TH17细胞比例呈显著负相关关系(rTH1=-0.367，P=0.021；rTH17=-0.406，P=0.016)，而与TH2细胞比例存在正相关关系(r=0.467，P=0.006)。但其与Treg细胞比例间相关关系并不显著，无统计学意义(r=-0.009，P=0.628)。

表1 URSA患者外周血TH1、TH2、TH17、Treg细胞比例(%)

图1 URSA患者与对照组外周血TH1、TH2、TH17、Treg细胞流式检测

3 讨论

URSA病因复杂，免疫功能异常变化与之相关。正常妊娠中母胎界面免疫耐受发挥至关重要作用。研究发现TH1/TH2偏移现象与成功妊娠密切相关，正常妊娠TH2细胞占主导地位，而URSA等妊娠失败患者体内TH1则占优势。本研究通过流式细胞分析检测外周血TH1和TH2细胞，发现URSA患者存在TH1/TH2偏移现象，以TH1增多为主，这与先前报道相一致[6]。新型T细胞亚群TH17及Treg细胞同样在免疫系统中发挥重要作用。既往研究证实Treg细胞在URSA妇女体内显著下降，表明其可能参与母胎免疫耐受，有助于维持正常妊娠[7]。本研究也发现URSA患者Treg细胞比例显著下降。TH17细胞与Treg发挥相反生理效应，过多的TH17具有抑制妊娠的作用。Wu等[7]报道了TH17与Treg失衡与URSA发病过程相关，Yang等[8]也发现淋巴细胞免疫疗法可显著增加URSA患者Treg细胞比例，且有助于改善妊娠结局。本研究中TH17细胞比例增加与Treg细胞比例下调和以上结果相符，进一步证实了URSA患者中不仅存在TH1/TH2偏移，亦会出现TH17/Treg失衡，这些免疫功能异常变化可能在URSA病因学中发挥关键作用。但TH1/TH2及TH17/Treg偏移的潜在机制尚不清楚。IL-33是IL-1家族新成员，可通过激活包括TH2细胞在内的多种固有免疫细胞诱导Ⅱ型免疫反应，在多种炎症性疾病中扮演重要角色。罗金等[9]在RSA小鼠胎盘组织中发现IL-33表达水平下降，而本研究发现IL-33在URSA患者中亦存在显著下调现象，也进一步证实IL-33与URSA间的关联。此外，有研究表明IL-33可诱导TH2型细胞因子分泌，参与TH2型细胞反应[10]。Zhu等[11]近期证实IL-33在结肠炎小鼠模型中可抑制TH1和TH17型细胞反应。以上结果提示IL-33与TH1、TH2和TH17细胞反应相关。在URSA患者中发现IL-33与TH1、TH2和TH17细胞比例确实存在相关关系。而目前关于IL-33与Treg细胞间的作用研究甚少，两者关系不明，而本研究中发现URSA患者中两者无显著相关性。

本研究尚存在不足之处，比如纳入研究的样本量较少，若要明确IL-33对于URSA是否具有临床预测价值，需要加大样本量并进行多中心联合研究。同时，未来将在动物实验中验证IL-33是否可以改善URSA小鼠的妊娠结局，以及其对TH1、TH2、TH17和Treg细胞的影响，明确IL-33参与URSA的免疫学机制。总之，本研究初步证实URSA患者中存在IL-33下调现象，且IL-33与TH1、TH2、TH17均存在相关性，而与Treg间无显著相关性。提示IL-33参与URSA发病过程，并可能与TH1、TH2、TH17和Treg等免疫细胞存在关联。

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(本文编辑：刘群)

Serum IL-33 level and its correlation with TH1, TH2, TH17 and Treg cells in patients with unexplained recurrent spontaneous abortion

FEIQian-qiana,DINGJia-yia,SHIWei-honga,JINHuaa,TANXiao-fanga,CHENXiao-bob
(a.CenterforReproductiveMedicine,b.PrenatalDiagnosticCenter,NantongMaternalandChildrenHealthCareHospital,Nantong226000,Jiangsu,China)

Objective To investigate the serum IL-33 level and its association with TH1, TH2, TH17 and Treg cells in patients with unexplained recurrent spontaneous abortion(URSA). Methods Forty-six URSA patients and 40 healthy controls were enrolled. The proportions of TH1, TH2, TH17 and Treg cells in peripheral blood samples were determined by flow cytometry, and serum IL-33 levels by ELISA. Results The levels of serum IL-33 in URSA patients were significantly lower than that in healthy controls. The proportions of TH2 and Treg cells in URSA patients were significantly lower than that in healthy controls(P<0.05), while the proportions of TH1 and TH17 cells in URSA patients were significantly higher than that in healthy controls. Serum IL-33 levels were negatively correlated with the proportions of TH1 and TH17 cells, and positively with that of TH2 cells, while no correlation with Treg cells. Conclusion Serum IL-33 levels decrease significantly in URSA patients, and are correlated with the proportions of TH1, TH2 and TH17 cells, indicating that IL-33 may be associated with TH1, TH2 and TH17 cells in URSA patients.

unexplained recurrent spontaneous abortion; IL-33; helper T cell; regulatory T cell

南通市科技计划项目(HS2014012)。

费倩倩，1983年生，女，主管技师，主要从事生殖遗传和辅助生殖技术研究。

陈小波，主管技师，E-mail：95235205@qq.com。

10.13602/j.cnki.jcls.2017.04.11

R446.6

A

2017-01-03)