多点平皿培养法在甲真菌病病原菌分离中的应用

陈敏 梁强

目的探讨多点平皿培养法在甲真菌病病原菌分离中的应用，为临床诊断甲真菌病原菌提供参考依据。方法选取广东医科大学附属医院皮肤科门诊就诊的甲真菌病患者100例作为研究对象。收集病变甲屑标本124例进行甲真菌病原菌分离与鉴定，根据分离方法的不同分为观察组采用多点平皿培养法，对照组采用常规试管培养法，比较分析不同培养方法病原菌分离的阳性率、病原菌种类的构成以及其污染率。结果观察组124例甲屑标本，阳性84例（67．7%），污染16例（12．9%）；对照组124例甲屑标本，阳性61例（49．2%），污染5例（4．0%），组间对比，差异均具有统计学意义（P＜0．05）；观察组和对照组致病菌分离鉴定结果显示，皮肤癣菌分别为51．19%、70．49%、酵母菌分别为35．71%、19．67%、霉菌分别为2．38%、0．00%。观察组和对照组分别检出混合感染9例、6例，差异无统计学意义（P＞0．05）。结论甲真菌病原菌分离中采用多点平皿培养法，具有较高的阳性率，较常规试管培养法能提高病原菌的检出率。

甲真菌病；诊断；真菌培养；多点平皿培养

甲真菌病（onychomycosis）是临床最为常见的慢性浅部真菌病，造成该病发作的机制是在皮肤癣菌、酵母菌等丝状真菌作用下导致的具有传染能力的疾病[1-2]。医学将其分为原发性和继发性真菌感染两类，前者在极大程度上影响了全人类的身体健康，占真菌皮肤感染患者的三分之一，并对患者正常日常生活、工作行为能力造成了极大制约[3]。而要想有效科学的治疗该类疾病，首要的是能够对该病有精准的诊断[4]。当前主要诊断方式是在显微镜的帮助下，对患者丝状真菌或孢子进行观察，但此方法无法准确判断致病真菌类型，进而无法制定消除致病真菌方式[5-6]。本文以我院100例甲真菌病患者的124例甲屑标本作为研究样本，进行多点平皿培养和常规试管培养，并比较其在甲真菌病原菌分离中的应用价值。

1 研究对象

选取2015年6月—2016年6月广东医科大学附属医院皮肤科门诊诊治的甲真菌患者100例为研究对象，收集病变甲屑标本124例进行甲真菌病原菌分离与鉴定，所有标本均采用多点平皿培养法和常规试管培养法，观察组为多点平皿法，对照组为常规试管培养法。所选100例患者中，男54例、女46例，年龄6～78岁，病变部位有指甲真菌病9例、趾甲真菌病68例、指甲和趾甲混合感染者23例；共124例甲屑标本。所选患者均确诊为甲真菌病，具有典型的甲真菌病临床表现，如甲颜色或形态发生改变，甲板明显增厚、表面可见明显白班形成，甲下堆积有碎屑等，行甲屑直接镜检发现菌丝或孢子。排除慢性湿疹、银屑病等其他疾病引起的甲改变，免疫缺陷性疾病或近3个月内口服抗真菌药物以及近1个月外用过抗真菌药物患者。

2 研究方法

2.1 标本收集

每个患者均选择其最严重的病甲作为取材指（趾）甲，取患甲的碎屑，先进行严格消毒，遵守无菌原则以刀片进行刮取。根据病甲的类型，采取不同的取材方法。远端侧位甲下型：伸入远端甲板内侧，刀口朝上刮取甲床甲屑；白色浅表型：取甲板表面甲屑；近端甲下型：先削去正常甲板，再从近端甲床取材；全甲营养不良型：取整甲表面甲屑。

2.2 培养基

培养基可选择玉米粉吐温琼脂培养基、米粉小培养基以及毛癣菌营养琼脂培养基

2.3 分离培养方法

2.3.1 常规试管真菌培养 取加入培养基的试管，在无菌操作台内取碎屑标本接种于斜面培养基，放置培养。

结果判定：培养基中的培养点细菌鉴定，有一个以上鉴定出皮肤癣菌，即为培养出致病菌。若不是皮肤癣菌，则连续培养3次，结果为同一病原菌则判定为致病菌，否则判定为污染菌。

2.3 两组心率变异性和心率减速力指标分析 研究组SDNN、SDANN、RMSSD、LF、HF及心率减速力水平明显低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表3。

2.3.2 多点平皿法真菌培养 取平皿培养基，选择培养基边缘呈圆形的10个点进行接种培养。

结果判定：培养基中的培养点细菌鉴定，有1个以上鉴定出皮肤癣菌，即为培养出致病菌；培养的病原菌若为酵母菌或霉菌，若同时有4个以上接种点鉴定为同菌种，则判定为致病菌，反之若无4个以上接种点鉴定为同菌种，则判定为污染菌；培养的病原菌若鉴定为两种，则判定为混合感染。

2.4 菌种鉴定

培养4周，未发现菌落，则判定为阴性。

鉴定菌种主要根据培养的菌落特征，以及镜下细菌的形态，其中酵母菌鉴定，需采用科玛嘉念珠菌显色培养基与API进一步鉴定明确。

2.5 统计学方法

采用SPSS 22.0软件对数据进行分析处理，计数资料以率表示，采用χ2检验，以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

3 结果

观察组124例甲屑标本，阳性84例（67.7%），污染16例（12.9%）；对照组124例甲屑标本，阳性61例（49.2%），污染5例（4.0%），两组阳性率、污染率比较，差异均具有统计学意义（χ2=23.64，P＜0.05；χ2=16.48，P＜0.05）；且观察组检出混合感染9例（10.71%），对照组检出6例（9.83%），两种检测方法在单一感染和混合感染的检出率比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

3.2 两组培养方法三种致病菌构成比较

病原菌菌分离结果显示，多点平皿三种致病菌构成比，组间对比，差异具有统计学意义（P＜0.05），见表2。

3.3 多点平皿培养法结果分析

选取124例甲碎屑标本，经多点平皿培养共发现84株致病菌，其中有29株取材自指甲标本，55株取材自趾甲标本。指甲标本中三类菌种种类分别为皮肤癣菌24株、酵母菌5株和霉菌0株，而在趾甲标本中分别为48株、6株和1株，两组菌种比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。本文12例手足甲真菌病患者同时从指甲和趾甲中分离出致病菌，具体为红色毛癣菌9例、指（趾）间毛癣菌2例、酵母菌1例。多点平皿培养法检出16例混合感染，均为红色毛癣菌混合其他菌种感染，其中并发指（趾）间毛癣菌感染7例，并发酵母菌8例，并发霉菌1例。

表1 两组培养方法分离结果分析（n）

表2 两组培养方法三种致病菌构成比较（n）

表3 多点平皿培养法对指甲和趾甲病原体阳性率与污染率比较 [n（%）]

另外，多点平皿培养的84株致病菌，29株指甲标本，55株趾甲标本，分析不同来源标本阳性率和污染率，结果显示趾甲标本的阳性率高于指甲标本，但两种标本的污染率对比，差异无统计学意义（P＞0.05），见表3。

4 讨论

随着医学研究的深入，皮肤癣菌、酵母菌还有丝状真菌引发该病发作的认识已经深入人心，因此该病称为“甲真菌病”。但因该病而分离出的酵母菌、霉菌到底是导致该病发作的机制，还是该病的并发症，医学界仍然存在极大争议[7]。且该病具有较强的传染能力，可影响全人类的身体健康和生存状态，因而受到世界卫生组织的极大重视。

当前该病的诊断主要是通过临床诊断、KOH直接镜检等方式来实现，但因为器材等原因的限制，经常诊断出假阴性，而阳性占50%～70%。一般而言，医护人员可以通过真菌真正来判断皮肤癣菌类型，对无特征显现的真菌可以通过镜检检查、察氏培养基等来识别曲菌和青霉，PDA培养基也能起到区分毛菌、暗色孢科真菌等不同种属真菌。但通过培养基来鉴定真菌，常常会因为皮肤癣菌、丝状真菌或者酵母菌的感染，而无法区分其是否是致病真菌，造成鉴定结果难以让人信服的情况[8-9]。

总的来说，过去医学界采用的诊断、鉴定方式，主要有这样几个问题：（1）检查出致病真菌的几率较低；（2）对非皮肤癣菌的致病真菌很难鉴定，难以判断酵母菌、霉菌到底是致病真菌还是培养基污染菌。（3）对混合感染也难以进行鉴别[10-11]。

早在上世纪七十年代，Walshe、English等相关专家就指出，可以通过推算标本培养中生成的非皮肤癣菌菌落数量，来判定是否为非皮肤癣菌甲真菌病。近几年来，相关专业人士提出并进行了多点平皿接种真菌培养方法，来完成甲真菌病的诊断工作。当前，国内很多医院也都采用此方式来完成甲真菌的诊断，但直到目前，医学界仍未对此种诊断方式有统一的论断[12]。

本文采用多点平皿接种培养真菌和试管点植培养真菌两种不同的培养方法，培养甲真菌病致病真菌，并将其具体的诊断情况进行比较，发现多点接种培养法阳性率高于传统点植培养法，差异有统计学意义（P＜0.05）。这是因为多点接种法真菌培养，等同于同时展开真菌培养，从而加大了致病真菌被发现的几率，极大程度上减少了假阴性的几率。通过对比两方式分离出的皮肤癣菌、酵母菌，两种方式呈现出明显的差异（P=0.001），通过多点接种法培养出来的真菌数量，远远超过了常规试管点植真菌培养方法。由此可见，在甲真菌病的培养分离上，多点平皿培养法更加适用，尤其是对于非皮肤癣菌的分离。理论上来说，多点接种法能够避免污染菌以及混合感染造成的不利影响，而且生长速度较慢的皮肤癣菌，很难被长成速度较快的霉菌所吞噬，也就极大提升了皮肤癣菌被诊断出来的几率[13]。这是由于多点接种法真菌培养引发非皮肤癣菌机制不清导致的，可以结合甲真菌病致病机制来证实。假如得出的结果和甲真菌病致病原理相同，则证判定标准是准确的；相反，则说明此类方法对非皮肤癣菌致病机制判断仍然缺乏精确性，需要进一步的研究。所以，当前对多点接种培养法诊断非皮肤癣菌致病机制的判断仍然需要更为深入的研究[14]。

混合感染在甲真菌病患者群体中有不小的比例，但医学界对混合感染的诊断方式仍然未能达成统一的见解，特别是当接种点分离既分离皮肤癣菌又分离出霉菌，如此是真菌混合感染还是污染及感染难以区分开来。本次研究中，两种方法均检出混合感染，多点培养法检出混合感染9例（10.71%），常规培养法检出6例（9.83%），两种检测方法在单一感染和混合感染的检出率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。黄怀球等[15]研究通过多点接种法真菌培养诊断出2例混合感染，而通过点植培养法却未能检查出混合感染。而在实验组患者群体中，却发现了很多混合感染的患者，结果证明多点接种法更加有利于混合感染的诊断。本文与其研究结果不一致，考虑为未能检查出更多的病例，未能体现出较为明显的统计学差异，亟待更为深入的研究工作。以上证明，多点接种法能够提升家真菌病的诊断。

本文所取124例标本，分别采用多点平皿培养和试管培养两种培养方法，培养分离菌种，实验证明多点培养方式阳性率更高，能够分离更多病菌，而且发现酵母菌的几率也大大提升。这是因为多点培养法能够同时采集较多甲屑、有较多接种点数以及菌落容易发现区分等原因。此外，还能在极大程度上减少大菌落对小菌落病菌的遮掩情况。虽然多项研究明确多点培养法在发现、鉴定酵母菌中的优势，但在临床上，却缺乏足够的认识和推广。这是因为该方法也存在易于污染、能够提升高假阳性等问题，所以科学操作、准确取材以及提升高培养准确率是当前医学研究的重点，只要改进这些缺陷，此类诊断方式才能在临床上获得更为广泛的应用。

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Multiple Spots Inoculation of Fungi in Sabouraud Agar for the Diagnosis of Onychomycosis

CHEN Min LIANG Qiang Pathogen Biology Laboratory Basic Medical College of Guangdong Medical University, Dongguan Guangdong 523808, China

ObjectiveTo explore the application of multi-point plate culture in the isolation of onychomycosis pathogens.Methods124 cases of pathological specimens of the lesions were collected for the isolation and identi fi cation of fungal pathogens. The observation group was treated with multi-point plate culture method, while the control group was treated with conventional tube culture method.ResultsThe observation group of 124 cases of a chip were positive in 84 cases (67.7%), 16 cases of pollution (12.9%); 124 cases in the control group a crumb specimens, 61 were positive (49.2%), 5 cases of pollution (4.0%), the comparison between the two groups, the differences were statistically significant (P＜ 0.05); the observation group and the control group the pathogen identificationresults showed that dermatophytes were 51.19%, 70.49%, 35.71%, 19.67% respectively, yeast and mold were 2.38%, 0.00%. In the observation group and the control group, 9, 6 cases of mixed infection were detected, and there were no signi fi cant difference betweentwo groups (P＞ 0.05).ConclusionThe method of multi-point plate culture in the isolation of onychomycosis fungi has a higher positive rate, which can improve the detection rate of pathogenic bacteria compared with the conventional culture method.

onychomycosis; diagnosis; fungal culture; multi-point plate culture

R446．5

A

1674-9316（2017）09-0007-04

10．3969/j．issn．1674-9316．2017．09．004

广东医科大学基础医学院病原生物学实验室，广东 东莞523808