周曼舒，张饮江，2，方敬雯，谷 月，姬 芬，严 铭，陈晓君

（1上海海洋大学水产与生命学院，上海，201306；2水域环境生态上海高校工程研究中心，上海，201306.）

不同组培方式马来眼子菜对水质净化效果研究

周曼舒1，张饮江1，2，方敬雯1，谷 月1，姬 芬1，严 铭1，陈晓君1

（1上海海洋大学水产与生命学院，上海，201306；2水域环境生态上海高校工程研究中心，上海，201306.）

为研究开放式组织培养方式的可行性与应用价值，采用传统组织培养与开放式组织培养马来眼子菜（Potamogetonmalaianus），通过围隔试验比较两种方式下培养的马来眼子菜对水质的净化效果。结果表明：不同培养方式的马来眼子菜对水中DO（溶解氧）、TN（总氮）、TP（总磷）、NH3-N（氨氮）、COD和Chl.a（叶绿素a浓度）无显著性差异，对水质净化效果差异基本相同。并且相对空白对照，马来眼子菜在其生长季节表现出较好的水质净化效果，因此开放式组织培养方式具较好的应用前景。

开放式组织培养；马来眼子菜；净化效果；围隔试验

水体富营养化程度扩大，沉水植物群落严重受损，导致水质恶化，造成水生态系统功能退化。研究表明［1-2］，沉水植物恢复后，水体营养循环速度降低，浮游植物过度增长得到控制，因此，恢复健康水生态系统的自净能力是长期稳定地解决水污染的根本措施，而沉水植被的种苗快速规模化繁殖是困扰沉水植被恢复以及水体生态修复与改善水质的难点之一，受到人们的高度重视。

通过无菌操作将外植体接种到培养基，在人工条件下发展成完整植株的过程为传统组织培养方式，陆生植物、挺水植物和部分沉水植物已有研究，这是繁殖水生植物种苗生产的主要方法，但这种传统植物组织培养对环境条件要求严格，需投入大量人力、物力，成本较高，在实际生产中难以广泛应用。开放式组织培养通过在培养基中加入抑菌剂，让植物在相对开放条件下可良好生长，已成功应用于菊花及兰花、葡萄、魔芋、香蕉等植物中［3-7］，既降低成本，又有利于规模性工厂化养苗生产，因此研究开放式组织培养沉水植物具有重要的学术价值与应用意义。

本研究在前期试验基础上，结合利用凯松作为抑菌剂的开放式组织培养模式，通过增殖阶段最佳培养基的选择结合最佳生根培养基质培养出的马来眼子菜组培苗，与传统组织培养方式培养的组培苗，建立试验围隔，对两种不同培养方式的马来眼子菜对水质净化能力进行深入研究。

1 材料与方法

1.1 供试材料

在上海海洋大学组培实验室，通过开放式组织培养与传统组织培养后培养成功的组培苗，并于2014年3月在水域生态环境工程上海研究中心实验室水槽（500 mm×400 mm×300 mm，16—20℃）分别进行暂养（湖泥从上海普露湾试验塘采取），筛选生长健壮，并且长势相对一致的马来眼子菜（Potamogeton malaianus）幼苗作为该围隔试验的供试材料。

1.2 试验围隔

试验于2014年4—11月进行。试验围隔建立于上海海洋大学普露湾试验基地池塘中，试验塘长100 m，宽20 m，深1.8 m，基底泥质。试验前，先将池水抽干并且清理底质。从南向北每排3个，构建3排，用PVC防水布围隔（1.5 m×1.5 m×1.7 m），PVC膜并随围隔支架深入池塘的基底0.3 m，形成围隔。然后向围隔内注入相同的水源，水位均为1.5 m，此时，围隔高出水面0.2 m，围隔内外基本无水体交换。试验开始后，围隔内不再引入任何其他水生生物，无投饵，也不注水或排水（图1）。

1.3 试验方法

1.3.1 不同方式培养出的马来眼子菜移栽密度与比例

试验围隔设置完成并加水稳定7 d后，开始移栽组培好的马来眼子菜幼苗。试验设分为三组：传统组培培养苗、开放式组培培养苗与空白对照，每个试验组设3个重复。考虑到围隔间的可能误差以及水位在试验期间的波动，设所有围隔中的水量均为3 m3，马来眼子菜100颗/m3，各试验组围隔随机设置（表1）。

图1 围隔试验装置Fig.1 Them esocosm experiments set

表1 两种培养方式对马来眼子菜增殖培养的影响Table 1 Effects of two trainingmethods on Potamogeton malaianus proliferation culture

1.3.2 水质主要指标变化

试验期间，间隔两周的15：00于所有试验组水面下0.5 m处取样，并采用便携水下温度计，便携pH计，便携式溶氧仪，便携式电导仪进行现场检测，TN、TP、NH3-N、COD以及Chl.a（叶绿素a浓度）均采用《水和废水检测分析方法》（第四版）相关方法测定。

1.4 数据分析

试验数据为平均数和标准差（Mean±SD），本试验中重复较少，因此，采用单因素方差分析，并选用LSR多重比较来比较均值间的差异显著性，显著性水平为P＜0.10。数据整理与统计分析均采用Excel软件进行。

2 结果与分析

2.1 不同试验组水体水温的变化

由图2可知，试验期间，所有试验围隔中水温的波动变化基本一致，均随着季节的变化呈现先上升后下降的变化趋势，空白对照与两种培养方式的试验组对比，皆无显著性差异。因此，各试验组之间环境温度因素的一致性减少了两种培养方式对水质影响误差。

2.2 不同试验组水体中DO浓度的变化

由图3可见，在试验初期，所有试验组中的DO均在7.85 mg/L左右。试验期间，随着水温的升高，大量藻类开始生长，因此初期DO会有所下降，这与7月1日水温升高，DO下降的试验结果一致，但由于马来眼子菜的作用使得传统培养与开放式培养试验组DO稍高于空白对照。随着马来眼子菜对环境的适应，生长趋势变好，溶氧也会相对于空白对照有所增加，此外，空白对照中的DO与各试验组中DO变化具有较高的一致性，各时期组间无显著差异。

图2 不同培养方式下水温的变化Fig.2 Changes of water temperature in different culture condition

图3 不同培养方式下溶氧的变化Fig.3 Changes of DO in different culture condition

2.3 不同试验组水体中TN浓度的变化

在水体生态系统中，水体中的有机物与底泥中大量生长的微生物以及其释放产物是上覆水中的氮重要来源，通过根系的截滤与枝叶的吸附作用，沉水植物去除上覆水中的氮，因此可达到净化水质的目的。由图4可见，在试验初期，TN水平基本上趋于一致，由于植物生长的水体环境发生变化，其中内部的微生物群落处于从一种稳态向另一种稳态过渡的阶段，植物体系尚未建立，导致水体中的总氮浓度变化无明显规律。到试验中后期，7月1日后，相对于空白对照的各试验组有了显著性的差异，即正值生长期的马来眼子菜表现出了良好的水质净化效果，而且两种培养方式的试验组中总氮的变化并无显著性的差异。

2.4 不同试验组水体中TP浓度的变化

TP的去除主要通过藻类细菌的合成代谢、化学反应以及水生植物的吸收等几种途径来完成的。由图5可见，在试验初期，总磷水平基本趋于一致，同样由于水体环境发生变化，其内部的微生物群落处于从一种稳态向另一种稳态过渡的阶段，植物体系尚未建立，导致水体中的TP浓度变化无明显规律。到试验中后期，7月1日后，相对于空白对照的各试验组有了显著性的差异，即正值生长期的马来眼子菜表现出了良好的水质净化效果，而且两种培养方式的试验组中TP的变化并无显著性的差异。

图4 不同培养方式下TN的变化Fig.4 Changes of TN in different culture condition

图5 不同培养方式下TP的变化Fig.5 Changes of TP in different culture condition

2.5 不同试验组水体中NH3-N浓度的变化

NH3-N的去除主要是通过微生物硝化与反硝化作用，生物的同化吸收等3种机制来完成的。由图6可见，在试验初期，由于水体环境发生变化，内部的微生物群落将从一种稳态向另一种稳态开始过渡，植物体系尚未建立，导致水体中的NH3-N浓度变化无明显规律。从7月1日后，水体温度开始迅速上升，导致水体藻类大量繁殖，形成郁闭现象，导致水体中大量植物腐烂，因此NH3-N浓度也开始上升，随之，两种培养方式的各试验组效果逐渐显现，相对于空白对照，马来眼子菜在其生长季节表现出较好的净化效果，而且这两种培养方式下马来眼子菜的净化效果并无显著性的差异。

2.6 不同试验组水体中COD浓度的变化

沉水植物主要通过对水体悬浮物的吸附作用与附着微生物的活动来对水体的有机物进行去除，因此水体中悬浮物的吸附量即降低水体中有机物的作用与其生物量和植物体的表面积成正相关。在试验初期，COD水平基本趋于一致，到试验中后期，7月1日后，相对于空白对照的各试验组有较明显的差异，即正值生长期的马来眼子菜表现出了良好的水质净化效果，而且两种培养方式的试验组中有机物的变化并无显著性的差异。

图6 不同培养方式下NH3-N的变化Fig.6 Changes of NH3-N in different culture condition

图7 不同培养方式下COD的变化Fig.7 Changes of COD in different culture condition

2.7 不同试验组水体中Chl.a浓度的变化

由图8可见，试验初期各试验组中的Chl.a均在3.95 mg/L左右，由于丝状藻漂浮水面，形成“遮蔽作用”，阻碍的浮游藻类的生长，但试验中后期，马来眼子菜适应水体环境，正值生长期，藻类开始逐渐死亡，遮蔽作用减弱，同时释放大量的营养物质，Chl.a开始上升，最高为（16.64±0.73）mg/L。

图8不同培养方式下叶绿素a的变化Fig.8 Changes of Chl.a in different culture condition

3 结论与讨论

通过观察与分析可知，通过两种培养方式培养的马来眼子菜，对比其水体中主要水质指标TN、TP、NH3-N、Chl.a无明显变化，发现对水质净化能力并无显著性差异，由于试验开展时间正值初夏，水温正在逐步上升，同时也滋养了大量藻类的生长与爆发，此水温也迎来了马来眼子菜的生长旺季，对水体中氮、磷的去除，相对于空白对照有一定优势，但两种不同培养方式下的净化能力（综合各个指标）并无显著性差异，即开放式组织培养的马来眼子菜的水质净化效果与传统组织培养的马来眼子菜相当［8-11］。并且，表1中两种培养方式下马来眼子菜的增殖芽数与增殖系数均表明其生长情况良好，进一步说明了开放式组织培养方式的可行性与应用价值。

3.1 水温变化对两种培养方式沉水植物生长的影响

水体环境中的温度变化较为缓慢，一般来说，温度对沉水植物的生长影响效果较小，但是温度对沉水植物的季节性生长影响较大，本试验中，水温维持在28—32℃，是马来眼子菜较为适宜的温度范围，因此两种培养方式沉水植物可以较好的生长。陈洪达等［12］通过测定菹草的呼吸作用与光合作用，得知菹草在生长过程中的产氧量随着温度的升高而升高，但当温度达到35℃以上时，它呼吸的耗氧量就会大于光合作用的产氧量。针对不同的沉水植物，由于其生理生态学特质的差异，因此也会致使温度对其生长产生的影响也会有所不同。并有研究［13-14］发现，从抽条生物量、抽条数目、抽条长度等来看，在32℃时黑藻比狐尾藻有着更好的生长反应。沉水植物的最佳生长状态都会对应着较合适的温度范围，过低或者过高都会对其生长产生一定的影响。

3.2 两种不同培养方式沉水植物对水质净化机制的主要体征

两种不同培养方式的沉水植物在生长过程中从水层和底泥中吸收营养物质，并转化为自身的营养结构物质，进而固定水体中的营养盐，水体中的有机氮被微生物分解转换，作为植物生长过程中的营养物质的无机氮也会被吸收，来合成蛋白质与有机氮，构成植物自身物质，再通过植物的收割从而达到去除的目的，同样，水体中的无机磷也是在植物的吸收与同化的作用下转化成了植物的ATP、RNA、DNA等物质，通过植物的收割被去除，还有研究表明，在生长过程中沉水植物吸收水中溶解性的氮，根系微生物对水体中的氮也有降解作用，因此减少了水体中的氮元素［15-17］；除此之外，在植物生长过程中，水中颗粒态的氮随着生物残体、浮游植物、泥沙等通过吸附、沉淀等原理，沉降到植物表面被植物的生物膜吸附，也会使水体中的氮减少［18］。一般来说，沉水植物对COD的去除过程会出现两个时期，可能由于刚开始时，植物在干净的水质中培养了一段时间，当放在污染的湖水中，植物由于缺乏有机质，所以吸收COD较快［19］，而且对水体也有一定的自净作用，使水质的COD降低。当过一段时间之后，植物吸收已经充足，并且由于沉水植物的新陈代谢作用，导致一些代谢的废物排入到水体中，此时水体中COD去除趋于稍微减缓的趋势［20-21］。

3.3 水体生态修复中沉水植物对水质的影响

生态技术与物理法及化学法相比，水生态修复尤其是利用沉水植物来净化修复水体，不仅去污能力高、不破坏原有生态环境，而且节省费用、能在一些水域中大面积应用。作为水生态系统中重要的生产者，沉水植物通过吸收水体中的氮、磷等营养物质来维持自身生长与繁殖的需要，并且也可以吸收、富集、降解各种有机污染物。

水体中沉水植物并非数量越多越好。水生植物对各种污染物（氮、磷、有机物、悬浮物、重金属、酚、除草剂等）有较好的去除能力，但在水面上极易屏蔽产生自屏效应，压迫环境导致二次污染。黄子贤［22］等通过设置不同种植密度梯度来研究4种常见沉水植物（伊乐藻、苦草、马来眼子菜和轮叶黑藻）对世博后滩公园生态水系氮、磷污染物的去除率，最终得到适宜得种植密度范围。

本试验池塘中原有挺水植物荷花，当荷花、马来眼子菜等的生长过于旺盛，就会超过水体承受能力，在水体表面形成郁闭的现象，从而会使大量植物体死亡、腐烂，进而向水体中重新释放各种营养素，导致水体的二次污染［23-26］，影响了其对水体的净化效能。低密度水生植物净化效果差，高密度易产生自屏效应，合理的控制植物种植密度才能有效提升水质。因此，在实际工程进展过程中，应该定期收割植物来减少植株腐烂凋亡向水体释放的营养物质十分必要，以避免水体的二次污染。

3.4 沉水植物植物组织培养快繁技术的探讨

湖泊生态恢复主要以沉水植被为重点，常采用直接播种或移栽幼苗，因此需要大量的幼苗库。近年来，国外对狐尾藻属（Myriophyllum L.）和篦齿眼子菜（Potamogeton pectinatus L.）的组织培养繁殖技术研究取得了进展，国内对菹草（Potamogeton crispus L.）、竹叶眼子菜（Potamogeton Malaianus Miq.）、苦草［Vallisneria natans（Lour.）Hara］、微齿眼子菜（Potamogeton maackianus A.Bennett）等植物织培养和快繁技术进行了研究［27-30］。采用植物组织培养技术可快速繁殖繁殖率低的植物，该法易掌握，但在技术应用上与产业化方面都存在一定问题。

目前生产中常遇见的技术难题，如污染、接种难、生根难、瓶苗生长不良、炼苗移栽成活率低等，尽管试验组培成功的植物已有很多，规模化生产的植物却不多。目前沉水植物的组织培养技术多局限于培养的最终结果及其因素的研究，如愈伤组织激素种类与比例等，但对培养过程中各阶段的环境因子，如温度、光照等协同性研究较少，故对不同种类沉水植物组织培养的基础研究很重要。其次，成本较高。组培养苗生产中的设备、技术投入大，养苗程序复杂，难以迅速推广应用。因此，优化培养基配方，建立高效快繁模式，是未来组织培养技术发展的有效途径。此外，人工操作过程中酒精气味大，费时费力，影响人体健康。故改善组培环境和操作系统的智能化，是未来组织培养发展的趋势。

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（责任编辑：张睿）

Water purification capability of different cultivating ways of Potamogeton malaianus

ZHOU Man-shu1，ZHANG Yin-jiang1，2，FANG Jing-wen1，GU Yue1，JIFen1，YAN Ming1，CHEN Xiao-jun1
（1School of Aquatic Products and Life Science；2.Engineering Research Center forWater Enviroment Ecology in Shanghai，Shanghai Ocean University，Shanghai201306，China）

In order to study the feasibility and application value of open tissue culture，the traditional and the open tissue culture were used to culture Potamogeton malaianus and to compare the water purification capability of Potamogeton malaianus with two culture ways through the mesocosm experiments.The results showed that changes of several indicators like DO，TN，TP，NH3-N，COD and Chl.a had no significant difference in two cultivating ways and the effect of water purification was basically the same.Comparing with the blank group，P.malaianus showed betterwater purification capability during the growing time，so the open tissue culture way was feasible.

Open tissue culture；Potamogeton malaianus；Purification effect；Mesocosm experiments

S645.9；Q948.8

：A

1000-3924（2017）02-052-06

10.15955j.issn1000-3924.2017.02.10

2016-09-19

国家水体污染控制与治理科技重大专项（2013ZX07101014-004）；上海市科委重大项目（08dz1900408）；上海市重点学科建设项目（Y1110，S30701）；上海海洋大学研究生科研基金项目

周曼舒（1993—），女，在读硕士，研究方向：水域环境生态修复。E-mail：shou＿zms＠163.com

，E-mail：yjzhang＠shou.edu.cn