刘旭良，王 兵，刘贻运，郑介柏

（广州市第十二人民医院骨科，广东 广州 510620）

・实验研究・

1,2-二氯乙烷诱导骨破坏的实验研究

刘旭良，王 兵，刘贻运，郑介柏

（广州市第十二人民医院骨科，广东 广州 510620）

目的探讨1，2-二氯乙烷诱导骨破坏的实验研究。方法3大鼠30只（雌雄各15只），随机分成A、B、C共3组10只/组（雌雄比例为1:1），A组染毒浓度225 mg/m3，B组450mg/m3、C组为未染毒对照组。建模，8周后处死，行骨密度检测，取左侧股骨行病理学检查并计算空骨陷窝细胞率，股骨头单位面积内骨小梁面积百分率、骨小梁宽度、最大脂肪细胞直径每高倍镜视野下空泡陷窝数量和单位面积骨小梁内胶原含量、荧光显微镜观察并测定四环素双标记之间的距离；取右侧股骨，测量骨灰重。结果与C组比较，A组和B组的骨密度和骨灰重、空骨陷窝细胞率，股骨头单位面积内骨小梁面积百分率、骨小梁宽度、最大脂肪细胞直径每高倍镜视野下空泡陷窝数量和单位面积骨小梁内胶原含量、四环素双标记之间的距离明显降低（P＜0.05）；与B组比较，A组的骨密度和骨灰重、空骨陷窝细胞率，股骨头单位面积内骨小梁面积百分率、骨小梁宽度和单位面积骨小梁内胶原含量、四环素双标记之间的距离明显降低，最大脂肪细胞直径每高倍镜视野下空泡陷窝数量明显增加（P＜0.05）。结论1，2-二氯乙烷诱导后大鼠的骨密度等各项指标出现明显下降，而且随着1，2-二氯乙烷浓度的增加，这些指标下降更明显，1，2-二氯乙烷可以诱导骨破坏。

1，2-二氯乙烷；骨密度；空骨陷窝细胞；骨灰重

二氯乙烷（dichloroethane，CH3CHCl2）是一种应用广泛的工业材料，但是其引起的中毒事件越来越多，因此对其毒性的研究也受到广大学者的关注。1，2-DCE中毒后机体内产生了大量的活性氧自由基（Reactive oxygen species，ROS），而ROS在致毒过程中发挥了重要作用[1]。而将二氯乙烷应用于对骨破坏的研究没有见详细的报道，因此本研究将1，2-二氯乙烷诱导大鼠的骨骼，从而确定1，2-二氯乙烷毒性对骨的破坏程度。

1 资料与方法

1.1 一般材料

30只雌雄大鼠（雌雄各15只），体质量为201.2±18.9 g，购于第三军医大学实验动物中心。1，2-二氯乙烷购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司，纯度：99.5%。

1.2 方法

1.2.1 建模分组

取大鼠30只（雌雄各15只），随机分成A、B、C共3组10只/组（雌雄比例为1:1），A组染毒浓度225 mg/m3，B组450 mg/m3，C组为未染毒对照组。建立1，2-DCE中毒大鼠模型。同等条件下饲养，分别于0周、4周和8周时用DPXNT双能骨密度仪检测骨密度，8周检测结束后处死所有大鼠，行病理学检查并计算空骨陷窝细胞率。荧光显微镜观察并测定四环素双标记之间的距离，取右侧股骨，测量3组大鼠的骨灰重[2]。

1.2.2 骨密度的测定

采用DPX-NT双能骨密度仪（美国 Datex-Ohmeda，Inc生产，通用电气医疗系统贸易发展（上海）有限公司提供，国食药监械（进）字2012第2301193号）对3组大鼠的骨密度进行测定。

1.2.3 病理学检查并计算空骨陷窝细胞率，股骨头单位面积内骨小梁面积百分率、骨小梁宽度、最大脂肪细胞直径每高倍镜视野下空泡陷窝数量和单位面积骨小梁内胶原含量采集3组大鼠的左侧股骨行进行病理学分析，组织HE染色后用双目Olympus光学显微镜分别在40×、100×、400×下观察，摄像后进行Image-pro-plus 图像分析系统分析，分别测得股骨头单位面积内骨小梁面积百分率和骨小梁宽度，每高倍镜视野下空泡陷窝数量。组织进行Masson染色后采用100×光镜下观察骨小梁内胶原分布情况，经摄像后存于Image-pro-plus 图像分析系统的计算机中，测得单位面积骨小梁内胶原含量[3]。

1.3 统计学方法

实验完成后应用SPSS 16.0软件，对数据进行统计分析，符合正态分布的计量资料用均数士标准差（s）表示。两组间均数的比较采用成组t检验，检验水准a=0.05，P＜0.05有统计学意义。

2 结 果

2.1 3组大鼠8周的骨密度和骨灰重比较

具体结果见表1，由表1可知与C组比较，A组和B组的骨密度、四环素双标记之间的距离和骨灰重明显降低（P＜0.05）；与B组比较，A组的骨密度、四环素双标记之间的距离和骨灰重明显降低（P＜0.05）。

表1 3组大鼠8周的骨密度、四环素双标记之间的距离和骨灰重比较（s）

表1 3组大鼠8周的骨密度、四环素双标记之间的距离和骨灰重比较（s）

注：与C组比较，*P＜0.05；与B组比较，#P＜0.05

分组 骨密度（g/cm2） 骨灰重（%） 四环素双标记之间的距离（mm）A组 0.18±0.02 64.4±21.5 0.15±0.01 B组 0.16±0.01* 62.5±19.8* 0.11±0.01* C组 0.22±0.05*#66.9±25.6*#0.19±0.02*#

2.2 3组大鼠8周的病理学指标

具体结果见表2，由表2可知与C组比较，A组和B组的空骨陷窝细胞率，股骨头单位面积内骨小梁面积百分率、骨小梁宽度和单位面积骨小梁内胶原含量明显降低，最大脂肪细胞直径每高倍镜视野下空泡陷窝数量明显增加（P＜0.05）；与B组比较，A组的空骨陷窝细胞率，股骨头单位面积内骨小梁面积百分率、骨小梁宽度和单位面积骨小梁内胶原含量明显降低，最大脂肪细胞直径每高倍镜视野下空泡陷窝数量明显增加（P＜0.05）。

表2 3组大鼠8周的病理学指标（s）

表2 3组大鼠8周的病理学指标（s）

注：与C组比较，*P＜0.05；与B组比较，#P＜0.05

分组 空骨陷窝细胞率（%） 股骨头单位面积内骨小梁面积百分率（%） 骨小梁宽度（μm） 空泡陷窝数量（个） 单位面积骨小梁内胶原含量（%）A组 7.02±1.06 52.9±10.5 70.9±16.9 7.89±1.04 41.9±10.2 B组 6.58±1.08* 48.9±12.5* 58.9±12.5* 9.84±1.24* 36.5±10.6* C组 7.98±1.21*#65.9±16.9*#93.6±21.8*#0.48±0.11*#57.9±18.9*#

3 讨 论

骨量减少和股骨头缺血性坏死是两种较常见的疾病，一旦发生便可能带来难以逆转的严重后果。二者在病变发展过程中会表现出相似的病理学改变，如骨细胞变性坏死，空骨陷窝数量逐渐增加[4]。骨细胞变形坏死、肥大的同时，将形成类似占位性病变，也可以导致骨内压增高，间接导致骨坏死[5]。目前临床治疗1，2-DCE中毒患者时均常规应用糖皮质激素，部分患者被观察到骨破坏，对此的解释多归因于糖皮质激素的诱导，而1，2-DCE在其中是否起到了作用则未见有相关研究。事实上，虽然糖皮质激素确实具有肯定的骨破坏诱导作用，但许多对糖皮质激素性骨质疏松和股骨头缺血性坏死的研究也表明，除了糖皮质激素以外，原发病也参与了骨破坏的诱导过程。有研究[6]显示1，2-DCE中毒患者进行糖皮质激素治疗后，而骨破坏发生率却反而明显较高，这说明了1，2-DCE参与了诱导骨破坏的过程。

本研究通过动物实验对此进行验证，通过采用不同浓度的1，2-DCE对大鼠进行喂食，处理8周后1，2-DCE的大鼠的骨密度和骨灰重、空骨陷窝细胞率，股骨头单位面积内骨小梁面积百分率、骨小梁宽度、最大脂肪细胞直径每高倍镜视野下空泡陷窝数量和单位面积骨小梁内胶原含量、四环素双标记之间的距离明显降低，而且随着1，2-DCE浓度增加，降低更明显。

1，2-DCE中毒后机体内产生了大量ROS，而ROS可诱导骨破坏形成，数据显示1，2-DCE中毒后骨破坏的发生率较高[7]。由此1，2-DCE可以通过ROS的作用诱导骨破坏的形成，而自由基清除剂可抑制这一过程。本研究将通过动物实验验证这一观点，目前，国内外尚未见相关报道。1，2-DCE中毒后发生的骨破坏常带来严重的后果，因此本研究具有重大临床意义和良好的社会效应。

综上所述，1，2-二氯乙烷诱导后大鼠的骨密度等各项指标出现明显下降，而且随着1，2-二氯乙烷浓度的增加，这些指标下降更明显，1，2-二氯乙烷可以诱导骨破坏。

[1] Niatsetskaya ZV,Sosunov SA,et al.The oxygen free radicals originating from mitochondrial complex I contribute to oxidative brain injury following hypoxia-ischemia in neonatal mice.[J].J Neurosci.2012,32(9):3235-44.

[2] 刘旭良,李斯明.1,2-二氯乙烷中毒糖皮质激素治疗后骨量减少与血脂、血钙相关性研究[J].中国骨质疏松杂志.2013,19(4):349-351.

[3] 刘旭良,李斯明.1,2-二氯乙烷中毒糖皮质激素治疗后骨量减少临床研究[J].中国现代医学杂志.2013,23(15):65-69.

[4] 杨亚军,崔 燎,FoxO/Wnt通路在氧化应激介导的骨质疏松中的调控机制[J]中国药理学通报,2013,29(1):27-30.

[5] Yin H,Zhu M.Free radical oxidation of cardiolipin:chemical mechanisms,detection and implication inapoptosis,mitochondrial dysfunction and human diseases.[J].Free Radic Res,2012,46(8):959-74.

[6] Hayatullina Z,Muhammad N,et al.Virgin coconut oil supplementation prevents bone loss in osteoporosis rat model.[J]. Evid Based Complement Alternat Med,2012,23(7):236-239.

[7] Nazrun AS,Norazlina M,et al.The anti-inflammatory role of vitamine in prevention of osteoporosis.[J].Adv Pharmacol Sci,2012,14(2):702-709.

本文编辑：王雨辰

R135.1

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ISSN.2095-8242.2017.010.1803.02

2014年度广州市医药卫生科技项目（项目名称：1,2-二氯乙烷诱导骨破坏的实验研究，项目编号：20141A010042）