梁梓强，梁士可，刘婷婷，李广宏，王方海

(中山大学有害生物控制与资源利用国家重点实验室//昆虫学研究所，广东 广州510275)

白背飞虱18S核糖体基因克隆及系统发育*

梁梓强，梁士可，刘婷婷，李广宏，王方海

(中山大学有害生物控制与资源利用国家重点实验室//昆虫学研究所，广东 广州510275)

以白背飞虱Sogatellafurcifera长翅雌虫为材料，提取其基因组DNA，以已知的半翅目昆虫18S rDNA全序列和白背飞虱18S rDNA部分序列为参考，通过PCR扩增出白背飞虱18S rDNA的未知部分序列，最后通过拼接，首次得到了白背飞虱18S rDNA的全长序列，长度为1 891 bp，碱基组成比例均衡，分别为：24.1% A；23.7% C；27.7% G；24.5% T。将此全长序列与分属6个目(半翅目、双翅目、膜翅目、直翅目、鞘翅目、等翅目)昆虫的18S rDNA序列进行比较，一共发现有4个保守区域，其中第二个区域发生插入或缺失的情况最少。以18S rDNA第二保守区域进行系统发育分析，发现原同翅目昆虫多数均与半翅目昆虫菜蝽亲缘关系较近，但原同翅目飞虱科昆虫，如白背飞虱、褐飞虱则与半翅目昆虫菜蝽的亲缘关系较远，表明近年来将原同翅目昆虫全部划归为半翅目还有待商榷之处。

核糖体；18S rDNA；白背飞虱

白背飞虱Sogatellafurcifera(Horvath)属半翅目Hemiptera飞虱科Delphacidae,是粮食作物水稻的重要害虫。白背飞虱成虫常会出现长、短两种不同的翅型个体，长翅型个体与短翅型个体相比有较强的活动能力，可以进行远距离迁飞扩散，但是繁殖能力较弱，白背飞虱不同翅型个体的比率是预测其种群动态变化的关键指标之一[1]。

昆虫基因组存在DNA甲基化现象[2]，同时DNA的甲基化与昆虫的多型现象密切相关[3]。白背飞虱中，DNA甲基化的研究主要围绕其对性别分化[4-5]和翅型分化[6]的作用展开了探索。利用甲基化敏感性代表性差异分析法(MS-RDA)分析白背飞虱长、短翅型雌成虫基因组，发现两个特异的DNA甲基化片段分别与18S和28S rDNA高度同源[6]。因此获得核糖体基因全长序列将有助于进一步分析其甲基化的具体式样和水平，找出不同翅型个体间存在的差异，从而有可能弄明白核糖体DNA甲基化对白背飞虱翅型分化的具体作用和机制。

真核生物核糖体是细胞内合成蛋白质的场所，由大、小两个亚基组成，主要成分为核糖体RNA和蛋白质。核糖体RNA具有自我复制和剪切功能。20世纪80年代以来，伴随着序列分析软件和计算机的发展，核糖体基因被广泛应用于昆虫的分子系统学研究[7]。

昆虫分类经典的方法主要以形态学为基础，相对简单且快捷，但限制形态学鉴定的因素较多，如昆虫生活环境、分类经验不足等，所以只靠形态特征进行分类，难以保证绝对的准确性。核糖体基因中18S rDNA具有序列高度保守性，并且许多生物的18S rDNA已被发表[8-9]，所以比较适合用于各类生物系统发生等进化关系的研究。

本研究参考了大量半翅目昆虫的18S rDNA全序列信息，克隆和分析了白背飞虱18S rDNA全长序列，为日后研究白背飞虱核糖体基因全序列甲基化水平和翅型分化的关系奠定基础。同时，我们将白背飞虱和六个目昆虫的18S rDNA序列进行比较分析，并根据18S rDNA的同源保守区进行了进化树的描绘，能为分子系统学研究提供参考。

1 材料和方法

1.1 供试昆虫

白背飞虱成虫采自广州市华南农业大学水稻试验田。将0.01 g长翅雌成虫置于液氮中研磨成粉，其基因组DNA的提取采用Universal Genomic DNA Extraction Kit(TaKaRa)，具体方法和步骤参照该试剂盒的说明书。

1.2 引物设计

从GenBank上搜索已经发表的白背飞虱18S rDNA序列(登录号JF773150，1 733 bp；登录号JX556779，1 281 bp；登陆号HM017250，1 200 bp)和白背飞虱18S-ITS1-5.8S-ITS2-28S核糖体序列(AB625607，AB625606，AB625605)，拼接成一条长度为1 856 bp的18S rDNA序列。

根据已经公布的半翅目昆虫的18S rDNA全序列(表1)，利用Megalign软件分析表1中的8个序列和上述已拼接好的18S rDNA序列，可以得知拼接的白背飞虱18S rDNA不是完整序列，缺失5′端部分。

表1 半翅目昆虫18S rDNA全序列的登录号
Table 1 Complete sequence of the Hemiptera 18S rDNA

SpeciesGenBankaccessionNo.PhilaenusspumariusU06480SpissistilusfestinusU06477HenestarisoschaniniAY324853LygushesperusU06476PachygronthaantennataAY324852HemiowoodwardiawilsoniAF131198OkanaganautahensisU06478HackeriellaveitchiAF004766

为了确定白背飞虱18S rDNA的5′端序列，我们分别对柑橘木虱(GCA_000475195.1)和褐飞虱(GCA_000757685.1)的基因组进行分析，找到其18S rDNA及其上游1 000 bp序列，根据18S rDNA 和上游序列的保守区域设计了一对引物用于扩增白背飞虱18S rDNA缺失的5′端序列(图1)，引物具体如下：

18S-F：5′ACGAATCATGAGCTGCTGAC 3′

18S-R：5′ATGGCTTAATCTTTGAGACAAG 3′

18S-F和18S-R预期扩增的序列大小为515 bp。

图1 PCR扩增白背飞虱18S rDNA 5′序列Fig.1 PCR strategy to amplify 5′sequence of S.furcifera 18S rDNA 灰色部分为白背飞虱18S rDNA上游序列；黑色部分为白背飞虱18S rDNA序列； 矩形部分为序列保守区域；18S-F和18S-R为扩增白背飞虱18S rDNA 5′端引物

1.3 PCR及检测

PCR的反应体系为：模板DNA 2 μL，上、下游引物各4 μL，Premix Taq(TaKaRa)25 μL，ddH2O 15 μL。PCR循环条件为：94 ℃ 30 s； 94 ℃ 20 s，51 ℃ 30 s，72 ℃ 24 s，30个循环；72 ℃ 8 min，4 ℃ ∞。反应结束后，取5 μL PCR产物进行w=1%凝胶电泳检测，然后将目的条带纯化回收，克隆并测序。

1.4 18S rDNA序列比对及系统发育分析

从GenBank中下载了昆虫纲6个目共9个18S rDNA的序列(表2)，结合白背飞虱18S rDNA全序列，利用DNAstar和MEGA5软件进行分析。

表2 昆虫18S rDNA序列来源
Table 2 The source of insect 18S rDNA sequence

OrderSpeciesGenBankaccessionNo.鞘翅目黄粉虫TenebriomolitorX07801双翅目果蝇DrosophilamelanogasterNR133559膜翅目蚜茧蜂LipolexisscutellarisAY216699直翅目中华稻蝗OxyachinensisAY037173等翅目澳白蚁MastotermesdarwiniensisAY491152半翅目褐飞虱NilaparvatalugensJF773148半翅目沫蝉PhilaenusspumariusU06480半翅目褐色橘蚜ToxopteracitricidaAY216697半翅目菜蝽EurydemamaracandicaJX997807

2 结果与分析

2.1 白背飞虱18S rDNA基因克隆及序列分析

白背飞虱18S rDNA 5′端序列的PCR扩增结果见图2。将PCR产物克隆后进行测序，测序完成后，与步骤1.2中已拼接出的白背飞虱18S rDNA序列进行再次拼接。

根据表1中8个半翅目昆虫的18S rDNA 基因序列，比较分析18S rDNA基因的起始位点(图3)，最终确定了白背飞虱18S rDNA全序列，共1 891 bp，其GenBank的登录号为KU518352。白背飞虱18S rDNA全序列碱基组成分别为：24.1% A；23.7% C；27.7% G；24.5% T，碱基组成比例均衡。

2.2 昆虫18S rDNA同源性及系统发育关系分析

通过使用DNAstar中的MegAlign程序对9个

18S rDNA序列进行排序处理，比对发现4个具有较高同源性的区域，分别相当于白背飞虱18S rDNA的1～202，335～629, 779～1 431和1 510～1 760 bp的序列。4个同源区域中，发生插入或缺失的几率低，主要为转换，而在非同源区域中，发生插入或缺失的几率大大增加，如双翅目或膜翅目昆虫在此区域就存在较多的插入序列。

图2 白背飞虱18S rDNA基因5′端序列扩增结果Fig.2 The PCR products of S.furcifera 18S rDNA 5′sequenceM: DL-2000 DNA Marker ; 1:扩增产物

基于以上的分析，如果根据18S rDNA全序列进行系统发育分析，结果就会不太可靠。由于在第二个同源区域中，出现插入或缺失的现象最少，所以本研究根据第二个同源区域进行系统发育树的构建，图4为所构建的系统进化树。

根据图4所示，我们发现白背飞虱和褐飞虱位于同一分支上，与双翅目的果蝇亲缘关系最接近，与鞘翅目的黄粉虫最远。而同属半翅目的沫蝉、褐色橘蚜、菜蝽3种昆虫亲缘关系接近，但与白背飞虱和褐飞虱的亲缘关系较远。

图3 半翅目18S rDNA基因起始位点Fig.3 The initiation site of Hemiptera 18S rDNA黑色箭头指向的核苷酸为半翅目18S rDNA基因起始位点

图4 基于昆虫18S rDNA保守区域的系统发生树Fig.4 Phylogenetic analysis of the 18S rDNA conserved domain

3 讨 论

核糖体基因一直以来都是人们研究的对象，18S rDNA基因同样也是白背飞虱研究的热点之一[6, 10]。过去我们虽然能得到很多有关白背飞虱18S rDNA基因的信息，但是这些基因信息均为部分片段，使得所做的研究具有局限性。通过对白背飞虱雌雄个体和长、短翅个体的MSAP图谱的分析，发现DNA甲基化有可能参与了白背飞虱性别和翅型分化的调控[11]，其中不同翅型白背飞虱基因组中存在与18S rDNA同源的差异DNA甲基化片段。本研究首次得到了白背飞虱18S rDNA全序列，为18S rDNA基因的甲基化分析提供可靠的序列参考，并且为今后研究18S rDNA基因甲基化式样和水平对白背飞虱性别和翅型分化的调控打下基础。

碱基组合比例对系统发育的构建有较大的影响[12]，白背飞虱及其它用于构建进化树的昆虫的18S rDNA的碱基组合比例均无偏异，故从18S rDNA基因角度可较为真实反映各目昆虫的进化情况。原属同翅目的白背飞虱、褐飞虱、沫蝉、褐色橘蚜与半翅目的菜蝽的亲缘关系各有不同，沫蝉、褐色橘蚜与菜蝽较接近，而白背飞虱和褐飞虱与菜蝽则较远。如果从18S rDNA基因进化角度来看，近年来把原同翅目昆虫全部划归为半翅目，似乎还值得商榷，因为飞虱科昆虫与半翅目昆虫间亲缘关系并不接近。

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Clonging and phylogenetic analysis of 18S rDNA gene fromSogatellafurcifera(Horvath)

LIANGZiqiang,LIANGShike,LIUTingting,LIGuanghong,WANGFanghai

(State Key Laboratory for Biocontrol and Institute of Entomology, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510275, China)

The long wing female adults ofSogatellafurciferawere selected to extract their genomic DNA. According to the complete 18S rDNA gene sequence from Hemiptera, the unknown 18S rDNA sequence ofS.furciferawas amplified by PCR. The complete 18S rDNA gene sequence ofS.furciferawas obtained for the first time by splicing the unknown and known 18S rDNA sequences, whole sequence length was 1 891 bp. Comparing 18S rDNA sequence fromS.furciferaand those from other insects, four conserved regions were found and the second region had the least insertion or deletion. Based on the second region, phylogenetic analysis was made and the results showed that most Homoptera insects used in this study had a close relatives withEurydemamaracandica(Hemiptera) except Delphacida.

ribosome; 18S rDNA;Sogatellafurcifera

2016-05-16 基金项目：广东省自然科学基金(S2022020002353,031628)；国家自然科学基金(311771844)

梁梓强(1991年生)，男；研究方向：昆虫分子生物学；E-mail：616661857@qq.com

王方海(1965年生)，男；研究方向：昆虫生理生化 ；E-mail：lsswfh@mail.sysu.edu.cn

10.13471/j.cnki.acta.snus.2017.01.019

Q965

A

0529-6579(2017)01-0121-04