杜尚可 沈睿杰 陈 杰 蒋霞云 邹曙明

(上海海洋大学农业部淡水水产种质资源重点实验室, 上海 201306)

团头鲂MSTN 基因cDNA 结构、表达及过表达对胚胎发育的影响

杜尚可 沈睿杰 陈 杰 蒋霞云 邹曙明

(上海海洋大学农业部淡水水产种质资源重点实验室, 上海 201306)

研究通过cDNA末端快速扩增法(RACE)克隆得到团头鲂生长抑制素(MSTN)基因的cDNA全长并分析了MSTN基因在团头鲂胚胎、成鱼组织中表达以及MSTN基因在胚胎中过表达情况。结果表明团头鲂MSTN基因的cDNA全长为2187 bp, ORF(开放阅读框)大小为1128 bp, 编码376个氨基酸。组织逆转录PCR (RT-PCR)结果显示, MSTN基因在肌肉、脑和精巢组织中大量表达, 肝脏、脾脏和卵巢组织中的少量表达, 肠、腮、心、眼和肾组织中的微量表达。胚胎逆转录PCR (RT-PCR)结果显示, 在0—44 hpf胚胎发育阶段, MSTN基因表达量较低; 而在48—52 hpf胚胎发育阶段, MSTN基因表达量逐渐升高。整胚原位杂交(WISH)结果显示, 胚胎发育的16 hpf时期MSTN基因主要在脊索中表达, 胚胎发育的28 hpf和55 hpf时期MSTN基因在脑中表达。MSTN基因过表达结果显示, 胚胎在体节发生期出现前-后轴拉长, 背-腹轴变短; 脊索发生扭曲, 强烈抑制体节发育而导致不分化等现象。研究为后续团头鲂MSTN基因的功能研究及团头鲂分子育种提供相关参考依据。

MSTN基因; 团头鲂; 原位杂交; 过表达

肌肉生长抑制素(Myostatin, MSTN), 又称GDF8 (Growth differentiation factor 8, 生长分化因子 8),属于TGF-β (Transforming growth factor β, 转化生长因子β)家族的成员[1]。该基因抑制骨骼肌的生长、发育。1997年, MSTN首次在小鼠中被发现, 之后鸟类[2]和牛、猪等哺乳动物中[3,4]也克隆得到了该基因。截止目前为止, 鱼类中斑马鱼[5]、刀鲚[6]、牙鲆[7]、草鱼[8]等十多个物种的MSTN基因已被克隆[9—12]。但关于团头鲂MSTN基因功能、表达的研究却鲜有报道。

蛋白酶酶切MSTN前体蛋白, 形成N端前肽和C端活性成熟肽, 酶切之后的N端前肽与C端活性成熟肽仍以非共价结合方式存在[13]。有研究表明, MSTN前肽不仅对MSTN成熟肽二聚体的准确形成有重要的作用, 还能够通过与成熟肽结合, 抑制MSTN基因与其受体结合, 阻断MSTN基因功能[14]。MSTN成熟肽二聚体与受体结合激活细胞内Smad2/ 3蛋白磷酸化, 并与Smad4蛋白形成复合体, 再与靶基因的DNA调控序列结合, 进而促进或抑制相关基因的转录表达[15]。利用转基因[16]、Morpholino[17]或RNAi[18]等技术, 已证实MSTN的突变或转录表达降低能促进斑马鱼肌肉的生长和发育。

团头鲂(Megalobrama amblycephala)草食性, 从20世纪60年代开始, 团头鲂就作为我国重要的淡水养殖种类[19], 2014年的总产量达7.8×108kg[20]。本研究克隆得到团头鲂MSTN基因全长cDNA的序列,并采用RT-PCR研究分析MSTN mRNA在组织、胚胎中的表达情况; 采用整胚原位杂交(WISH)方法研究MSTN mRNA在胚胎中的空间分布、表达情况; MSTN mRNA过表达对团头鲂胚胎发育的影响通过胚胎显微注射的方法来研究。本研究可为团头鲂MSTN基因的功能研究及团头鲂分子育种提供相关参考依据。

1 材料与方法

1.1 实验用鱼、胚胎

本研究所需的团头鲂雌雄亲鱼为上海海洋大学滨海基地团头鲂遗传育种中心培育的“浦江1号”。所用胚胎为开展人工授精所得, 胚胎发育过程中, 每隔2—3h换水1次。受精卵置于室温下人工培养、孵化, 每隔一段时间取成活胚胎50个, 在显微镜下观察发育时相, 然后将其放置于有RNA store保存液中以备后续提取总RNA。提取组织所需团头鲂成鱼为2龄鱼, 体重约500 g。

1.2 不同发育时期胚胎和成鱼不同组织总RNA的提取

活体剖杀团头鲂成鱼提取组织, 迅速置于液氮中快速冷冻。使用Trizol (Invitrogen)法提取经高速组织研磨仪研磨过的胚胎和成鱼组织中总RNA。使用琼脂糖凝胶电泳检测提取的总RNA的质量, 使用紫外分光光度计(Bio-Rad, 美国)检测提取的总RNA的浓度, 胚胎及各组织总RNA置于–80℃冰箱中低温保存。

1.3 MSTN基因全长cDNA的获得

根据斑马鱼(Danio rerio)MSTN基因序列设计一对特异性引物(mstn-F和mstn-R, 表 1)。以团头鲂肌肉组织总RNA反转录获得的cDNA为模板, PCR扩增MSTN基因小片段。3′-和5′-RACE扩增使用SMART RACE cDNA amplification kit (Clontech公司), 按试剂盒说明设计RACE和巢式引物(3′-mstn、3′-mstn nest、5′-mstn和 5′-mstn nest, 表 1), PCR扩增3′-和5′-RACE目的片段[21], 所用引物均由上海生工生物技术公司合成。

巢式扩增产物经过割胶回收(使用凝胶回收胶试剂盒割胶回收目的片段PCR产物)、连接[将上述PCR产物与pMD19-T (TaKaRa) 载体连接构建重组质粒]、转化(将重组质粒转化到感受态细胞DH5α中)、克隆(含氨苄青霉素的LB平板培养)、测序(使用琼脂糖凝胶电泳检测插入特定片段的重组子, 所获得的阳性克隆由上海生工生物技术有限公司进行测序)[8]。测序结果用BioEdit7.0 软件中的Clustal W程序比对, 去掉重叠、序列两端引物部分, 拼接得到团头鲂MSTN基因cDNA全长序列。

1.4 序列比较及进化树分析

采用BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ BLAST)、Clustal W软件进行核苷酸序列验证、翻译及氨基酸序列相似性分析。寻找正确的开放阅读框使用ORF (Open reading frame) finder程序(http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf)。应用Compute pI-Mw程序预测氨基酸序列等电点、Sigal P 3.0 server预测氨基酸序列相对分子质量和信号肽[21]。用Expasy在线软件进行蛋白翻译。用SMART (http://smart.embl-heidelberg.de/)预测结构域。运用Clustal W[22]比对序列, 用MEGA 5.05软件构建NJ (Neighbor- joining)系统进化树[23]。

1.5 逆转录PCR (RT-PCR)分析

根据已克隆出的团头鲂MSTN和鱼类18s基因序列信息, 设计团头鲂MSTN RT-PCR引物(MSTN RT-F和MSTN RT-R, 表 1)和18sRT-PCR引物(18sRTF和18s RT-R, 表 1)。以18s基因为内参, 对团头鲂不同时期胚胎和成鱼不同组织进行RT-PCR分析MSTN基因mRNA在团头鲂组织、胚胎中的表达。

1.6 整胚原位杂交(WISH)

根据已克隆出的团头鲂MSTN基因序列, 跨越ORF和3′-UTR区域设计一对引物, 表 1 中引物(mstn-in situ F/R)。扩增出大小为877 bp的目的片段, 将目的片段与pGM-T (TaKaRa) 载体连接。使用特定限制性内切酶(SacⅡ)37℃体外进行线性化酶切, 回收的酶切产物体外经RNA聚合酶(Promega)转录获得WISH所需RNA探针。

WISH所需胚胎, 使用3%的胰蛋白酶浸泡去除卵膜并将其置于4%的PFA中, 4℃保存24h。固定好的胚胎使用含有0.1% Tween-20的磷酸缓冲液(PBS)进行冲洗, 再转移到100%的甲醇中, 于–20℃放置1d以上, 4℃长期保存。WISH所使用的RNA核糖核酸探针采用地高辛标记, 胚胎与探针在60℃杂交超过16h, 与PBST-SB抗(抗地高辛抗体)与AP (碱性磷酸酶)偶联, 通过罗氏BM染料产生紫色不溶沉淀。显色完成后的胚胎在尼康SMZ1500显微镜下进行拍照。

1.7 团头鲂胚胎显微注射

依据克隆出的团头鲂MSTN基因全长序列, 设计过表达引物(表 1, mstn cds-F和mstn cds-R), 以团头鲂肌肉组织cDNA为模板进行PCR扩增。使用TIAN quick Maxi Purification Kit回收PCR扩增产物, 用限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ (Promega)体外进行酶切, 将酶切产物转化入pCS2载体中(本实验室保存中)。经凝胶电泳检测合适的重组pCS2-MSTN质粒送由生工生物技术公司测序、检测。使用限制性内切酶NotⅠ对检测合适的重组pCS2-MSTN质粒进行酶切, 酶切产物采用mMessage mMachine kit (Ambion, TX, USA)体外转录获得5′端加帽mRNA[24]。

显微注射装置由PV830 Pneumatic PicoPump显微注射器和SMZ-445体式显微镜(Nikon)组成, 装置由氮气气压驱动, 过转录表达MSTN mRNA浓度为500 pg/nL, 每次注射团头鲂1—2细胞期胚胎卵黄(靠近细胞部分)的量为1 nL。注射好的胚胎置于胚胎培养液中室温下孵化, 显微镜下观察胚胎的发育情况并拍照[24]。

2 结果

2.1 团头鲂MSTN基因cDNA序列分析

本研究克隆获得团头鲂MSTN基因全长cDNA序列(KY072939)。其cDNA序列全长2187 bp, 包括88 bp的5′ UTR (非编码区), 971 bp的3′ UTR (非编码区)。ORF大小为1128 bp, 可编码375个氨基酸,推测的MSTN前体蛋白等电点为5.02, 相对分子质量为92.34 kD。团头鲂MSTN基因编码蛋白包含有两大TGF-β蛋白结构域, 也有RXXR蛋白酶水解位点RIRR; 还有9个保守的半胱氨酸残基(图 1)。

2.2 同源性及分子进化分析

利用CLUSTAL W比对团头鲂、斑马鱼、草鱼和人类氨基酸序列分析(图 1), 团头鲂氨基酸序列与草鱼和斑马鱼MSTN1氨基酸序列的相似度分别为99%和97%, 而与草鱼和斑马鱼MSTN2氨基酸序列的相似度分别为68%和70%, 与人类氨基酸序列的相似度为68%。氨基酸序列分析结果表明, 克隆得到的团头鲂MSTN与草鱼、斑马鱼MSTN 1具有较高的相似度。Neighbor-joining系统进化树(图 2)结果表明, 克隆得到的团头鲂MSTN与草鱼、斑马鱼MSTN 1和鲤MSTN 1a, 1b型紧密聚为一支, 由此可以得知克得到的团头鲂MSTN基因为1型MSTN基因。

2.3 团头鲂MSTN mRNA在不同时期胚胎和成鱼不同组织中的表达分析

以18s基因为内参, 用表 1中引物(MSTN RTF/R和18s F/R)对团头鲂成鱼脑、肠、肝胰脏、鳃、心脏、眼睛、肾脏、肌肉、脾脏、精巢和卵巢等11个组织进行RT-PCR分析。结果显示MSTN mRNA在所有11个组织中均有表达, 但组织间表达量存在差异。肌肉、脑和精巢中的大量表达, 肝胰脏、脾脏和卵巢少量表达, 而在其他组织中微量表达(图 3A)。

以18s基因为内参, 用表 1中引物(MSTN RTF/R和18s F/R)对团头鲂0—52 hpf不同时期胚胎进行RT-PCR分析。结果显示团头鲂MSTN mRNA在胚胎发育的各个时期均有表达, 0—44 hpf微量表达, 4—52 hpf表达量逐渐升高(图 3B)。

2.4 WISH (整胚原位杂交)结果分析

团头鲂胚胎WISH (整胚原位杂交)结果(图 4)表明: 在16 hpf时, MSTN mRNA在16 hpf在脊索中表达(图 4A); 在28 hpf时, MSTN mRNA在眼睛和整个脑部(前脑、间脑、中脑、中脑-后脑边界、后脑)表达(图 5B); 而在55 hpf时, MSTN mRNA仅在眼睛、前脑和间脑中表达(图 4C)。对照组均无信号表达(图 4D, E, F)。

2.5 MSTN mRNA过表达结果分析

图 1 团头鲂与人类、斑马鱼、草鱼MSTN氨基酸序列比对及结构分析Fig. 1 Alignment of the deduced amino acid sequences of grass carp duplicated MSTNs with homologs from zebrafish, grass carp and humansRXXR蛋白酶水解位点黑色下划线表示, 黑色边框为TGF-β前肽结构域, 波浪边框为TGF-β或类TGF-β结构域保守的半胱氨酸残基用黑色箭头表示RXXR hydrolysis sites underlined black, black border for the TGF-β propeptide domain, a wave border for the TGF-β or TGF-β type domain conserved cysteine, residues with a black arrow

图 2 团头鲂MSTN基因氨基酸序列构建的NJ系统进化树Fig. 2 Neighbor-Joining phylogenetic tree of blunt snout bream MSTN putative peptides in vertebrates团头鲂MSTN用下划线标出, 数值代表置信的百分比The blunt snout bream MSTN is indicated by underline; Numbers of branches are percentage of times that the two clades branched as sisters

图 3 团头鲂MSTN在成体不同组织(A)和胚胎不同时期(B)的表达情况Fig. 3 The MSTN mRNA level in adult tissues (A) and during embryogenesis (B) in Megalobrama amblycephala

图 4 团头鲂MSTN mRNA在胚胎时期的整胚原位杂交结果Fig. 4 Whole-mount embryo in situ hybridization analysis of MSTN mRNA during different embryonic stages in blunt snout breamA、B和C. MSTN反义探针; D、E和F. MSTH正义探针; n. 脊索; e. 眼睛; f. 前脑; d. 间脑; MHB. 中脑、后脑边界; h. 后脑The MSTN antisense probe (A, B and C), the sense probe (D, E and F); n. notochord; e. eyes; f. forebrain; d. midbrain; MHB. midhindbrain; h. hindbrain

团头鲂MSTN mRNA过表达结果(图 5), 16 hpf后团头鲂胚胎发育出现明显异常, 在体节发生期显示为前-后轴伸长, 背-腹轴缩短, 包被层萎缩, 体型呈纺锤形(图 5A–H); 脊索和肌节的生长发育受到强烈抑制, 并造成脊索的轻微扭曲(图 5H)。显微注射结果表明, MSTN mRNA过表达对团头鲂胚胎背-腹轴和体节的形成过程造成重大的影响。在12 hpf,对照组、注射组的存活率分别为91, 6%和20, 7%;在16 hpf, 对照组、注射组的存活率分别为 75.4%和8.6%; 17 hpf时注射组胚胎全部死亡。

3 讨论

本研究克隆获得团头鲂MSTN基因全长cDNA序列, 序列全长2187 bp; ORF编码375个氨基酸, 属于TGF-β超家族, 有的RIRR蛋白水解位点和9个保守的半胱氨酸残基。或许是由于鱼类第三轮全基因组复制的缘故, 一些鱼类研究表明存在两个MSTN基因[25,26]。序列比对结果显示, 团头鲂MSTN基因氨基酸序列与斑马鱼、草鱼MSTN基因氨基酸序列相似性较高, 而与人类MSTN基因氨基酸序列相似性较低, 表明MSTN基因在长期的进化中高度保守。团头鲂MSTN与斑马鱼MSTN 1的相似性高达97%, 与斑马鱼MSTN 2的相似率仅为66%, 表明研究克隆得到的团头鲂MSTN应为1型基因。

研究小鼠发现, MSTN基因只在某一特定组织(骨骼肌)中大量表达, 少数组织(脂肪、心肌、乳腺)中少量表达[1], 而鱼类中MSTN基因却广泛表达[27]。团头鲂组织RT-PCR结果显示, 所有检测组织中MSTN mRNA均有表达, 但组织间MSTN mRNA表达量存在明显差异; 据此推断, 团头鲂MSTN基因除调节肌肉生长和发育外, 可能还存在其他的功能[17,28]。团头鲂不同发育时期的胚胎RT-PCR结果显示, MSTN mRNA在0—44 hpf的表达量较低, 48—52 hpf表达量逐渐升高。前期检测到的MSTN mRNA或许是少量保留的母源性转录本, 后期检测到的MSTN mRNA可能由于团头鲂胚胎发育36h后体节基本发育完成, 激活相关肌肉特异性基因的转录表达[29], 因而导致MSTN mRNA转录表达量逐渐升高。Vianello等[30]报道了斑马鱼一细胞期就检测到MSTN mRNA, 8 hpf降低; 而在16 hpf, MSTN mRNA表达水平显著增加, 由此可以验证前期检测到的MSTN mRNA是由少量保留的母源性转录本而来, 后期是由于胚胎发育过程中肌肉细胞分化而引起的MSTN mRNA表达量的上升。

图 5 MSTN过表达对团头鲂胚胎发育的影响Fig. 5 Overexpression of MSTN causes obvious embryonic abnormalities in Megalobrama amblycephala at 12 hpf and 16 hpfA为发育至12h对照组胚胎, B为发育至12h过表达胚胎; C-H均为发育至16h胚胎; C、E和G为正常对照组; D、F和H为MSTN过表达组; 黑箭头指示体节位置; 短线长度均为600 μmA are the wildtype embryos that developed at 12 h; B are MSTN mRNA-injected embryos that developmented at 12 h; C-H are all embryos that developmented at 16h; C, E and G are the wildtype embryos; D, F and H are MSTN mRNA-injected embryos. Dark arrows show the somites. Scale bar=600 μm

WISH结果显示, 胚胎发育早期MSTN mRNA广泛表达, 在脊髓中表达最明显; 这与草鱼MSTN mRNA的早期12 hpf胚胎原位杂交结果是一致的。团头鲂MSTN mRNA在中期28 hpf和晚期55 hpf胚胎中主要集中在脑中表达; 与草鱼MSTN mRNA中期胚胎中在脑中和尾节中; 晚期胚胎中在脑和脊索中表达结果不同[31,32]; 而斑马鱼MSTN mRNA的表达与团头鲂、草鱼MSTN mRNA完全相反, 斑马鱼MSTN mRNA在早期表达信号微弱, 在中、后期表达强烈[33];表明在不同种鱼之间MSTN mRNA的表达存在差异。团头鲂MSTN mRNA过表达造成表型发生变化, 主要体现在胚胎前-后轴伸长, 背-腹轴缩短, 使整个胚胎成纺锤形, 这与BMPs蛋白受到抑制后引起的胚胎形态变化非常相似[34,35], 这或许是由于MSTN基因的调控作用通过Smad蛋白发挥的同时,促进抑制性Samd蛋白的表达, 抑制了BMPs信号转递的结果[36]。本研究开展了团头鲂MSTN基因结构、功能、表达以及过表达研究, 可为下阶段MSTN基因的morpholino基因敲降或crispr/cas9敲除研究MSTN功能性缺失对胚胎发育的影响打下良好基础。

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[36]Ishisaki A, Yamato K, Hashimoto S, et al. Differential inhibition of Smad6 and Smad7 on bone morphogenetic protein- and activin-mediated growth arrest and apoptosis in B cells [J]. Journal of Biological Chemistry, 1999, 274(19): 13637—13642

MOLECULAR STRUCTURE AND EXPRESSION OF MYOSTATIN IN MEGALOBRAMA AMBLYCEPHALA AND ITS OVEREXPRESSION EFFECTS IN EMBRYO

DU Shang-Ke, SHEN Rui-Jie, CHEN Jie, JIANG Xia-Yun and ZOU Shu-Ming
(Key Laboratory of Genetic Resources for Freshwater Aquaculture and Fisheries, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)

The current study cloned a 2187 bp full-length cDNA of myostatin from blunt snout bream (Megalobrama amblycephala) by rapid amplification of cDNA ends (RACE). Its open reading frame is 1128 bp encoding 376 amino acids. RT-PCR analysis demonstrated that MSTN are extensively expressed in tissues of blunt snout bream with high level in the muscle, brain and testis is the highest, modest level in the liver, spleen, and ovary, and low level in intestine, gills, heart, eye, and kidney. During embryos development, mRNA level of MSTN is low from 0 to 44 hpf, whereas its expression increases gradually from 48 hpf to 52 hpf. The whole mount in situ hybridization demonstrated that MSTN mRNA was transcribed at different tissues of blunt snout bream’s embryos. MSTN mRNA were detected at the Notochord at 16 hpf. In 28 hpf and 55 hpf embryos, the MSNT mRNA level was very high in brain. Overexpression MSTN mRNA in embryos caused elongated anterior-posterior axis, shorter dorsal-ventral axis, slightly distorted notochord, and strongly inhibited somites. This study provides knowledge for subsequent blunt snout bream MSTN gene function research and molecular breeding of blunt snout bream.

Myostatin; Megalobrama amblycephala; In situ hybridization; Overexpression

Q344+.1

A

1000-3207(2017)03-0573-08

10.7541/2017.74

2016-07-11;

2016-11-25

国家科技支撑计划(2012BAD26B00); 国家自然科学基金(31272633和31201760)资助 [Supported by the Key Projects in the National Science & Technology Pillar Program (2012BAD26B00); the National Natural Science Foundation of China (31272633, 31201760)]

杜尚可(1988—), 男, 河南新乡人; 硕士; 研究方向为鱼类遗传育种。E-mail: dushangke1988@163.com

邹曙明, 教授, 博导; 研究方向为鱼类遗传育种。E-mail: smzou@shou.edu.cn