宋维春,裴志胜,孙宏元,梁志鹏,李欣怡,徐云升

(海南热带海洋学院 生命科学与生态学院,海南 三亚572022)

HPLC法测定纤维低聚糖的研究

宋维春,裴志胜,孙宏元,梁志鹏,李欣怡,徐云升

(海南热带海洋学院 生命科学与生态学院,海南 三亚572022)

本研究运用HPLC法,采用Inertsil NH2柱、示差折光检测器,以乙腈-水为流动相,探索纤维二糖、纤维三糖、纤维四糖、纤维五糖的检测条件.实验结果表明:在检测器灵敏度为+8,流速为1 ml/min,进样量为10 μL条件下,适宜检测条件是:流动相为乙腈:水(v/v)=65:35,色谱柱温度为41℃.在该检测条件下,峰高Y与浓度X的定量检测方程为:纤维二糖Y=3001X-147.6;纤维三糖Y=915.9X+411.6;纤维四糖Y=1328X+10002;纤维五糖Y=2029X-1357.

HPLC法;纤维二糖;纤维三糖;纤维四糖;纤维五糖

低聚糖能选择性地促进肠道内双歧杆菌和乳杆菌的增殖,体外实验研究发现Bacteroides等多种肠道共生细菌也能利用低聚糖[1].纤维低聚糖是一种功能性低聚糖,有广泛的开发应用前景,但因其不稳定、易分解,目前国内对其检测研究报道甚少.张南南[2]用凝胶色谱法分离纯化纤维三糖-纤维六糖、并用电喷雾电离质谱进行了分析检定.

HPLC法在低聚果糖的检测中有很多应用[3-4],与其它方法相比是一种高效简便无损害的分析方法[5],本研究采用Inertsil NH2柱、示差折光检测器,以乙腈-水为流动相,探索纤维二糖、纤维三糖、纤维四糖、纤维五糖的检测条件,为纤维低聚糖的制备提供检测依据.

1 材料与方法

1.1 仪器及条件

LC-2010AHT高效液相色谱仪(岛津公司);

RD-20型示差折光显示器(岛津公司);

色谱柱:Inertsil NH2柱、4.6×250 mm,5 μm；

检测器灵敏度:+8,流速:1 ml/min,进样量:10 μl.

1.2 试剂

纤维二糖(99%)(Elicityl-OligoTech公司);纤维三糖(95%)(Megazyme公司);纤维四糖(95%)(Megazyme公司);纤维五糖(95%)(Megazyme公司).

1.3 标准溶液配制

精确称取标准品,置于1 ml容量瓶中,用移液枪移取1000 μl的蒸馏水,振荡均匀,配成高浓度标准溶液;用移液枪移取300-700 μl高浓度标准溶液,再移入700-300 μl蒸馏水,配成1000 μl低浓度标准溶液.

1.4 进样处理

用5 ml的注射器吸取待测液,过0.45 μm滤膜并注射到2 ml进样瓶中进行检测.

2 结果与分析

2.1 柱温的确定

在流动相为乙腈:水=65:35条件下,分别采用柱温38℃、41℃、44℃、47℃,分别测定纤维二糖、纤维三糖、纤维四糖、纤维五糖标准溶液,实验结果如表1.

表1 柱温变化对谱峰的影响

注:↑为正常峰;-为未检出或有倒峰;空白为未实验

可见,在柱温为41℃和44℃时,纤维二-五糖均有正常谱峰出现,另从不同柱温时的保留时间比较可知,柱温越高,保留时间越短,组分之间的峰距变小,另外,纤维低聚糖在温度较高时容易分解,故选择41℃柱温进行实验.

2.2 流动相的确定

采用柱温41℃,在流动相(乙腈:水)分别为75:25、70:30、65:35、60:40条件下,分别测定纤维二糖、纤维三糖、纤维四糖、纤维五糖标准溶液,实验结果如表2.

表2 流动相比例变化对谱峰的影响

注:↑为正常峰;-为未检出或有倒峰;空白为未实验

由表2可见,纤维四糖只有在流动相比例为乙腈:水=65∶35条件下,才有正常谱峰出现,故选择流动相为乙腈:水=65∶35进行实验.

2.3 精密度实验

分别配制83.3 mg/ml纤维二糖溶液、100mg/ml纤维三糖溶液、17.9mg/ml纤维四糖溶液、4.9mg/ml纤维五糖标准溶液,每种溶液重复测定6次,实验结果如表3.

表3 精密度实验结果

2.4 标准曲线测定

在柱温41℃、流动相比例为乙腈:水=65∶35条件下,分别测定不同浓度的纤维二糖、纤维三糖、纤维四糖、纤维五糖标准溶液,确定峰高Y与样品浓度X的关系,实验结果如表4.

表4 标准曲线测定结果

2.5 标准品混合检定

将纤维二糖、纤维三糖、纤维四糖、纤维五糖标准溶液及葡萄糖溶液、纤维六糖溶液混合,在柱温41℃、流动相比例为乙腈:水=65:35条件下进行测定,混合物的色谱图如图1.

图1 纤维二-五糖混合物色谱图

与单个样品的谱图对比可知, 1为纤维二糖、2为纤维三糖、3为纤维四糖、4为纤维五糖.

2.6 样品检测

取香蕉茎干制成粉末[6-7],用酶法[8]降解制成含纤维低聚糖的混合物,在柱温41℃、流动相比例为乙腈:水=65:35条件下,进行色谱测定,实验结果如图2.

根据谱峰高度,用标准曲线计算可知,降解液中含纤维二糖31.7 mg/ml、纤维三糖84.1 mg/ml、纤维四糖11.3 mg/ml、纤维五糖8.4 mg/ml.

3 结论

(1)在检测器灵敏度为+8、以乙腈-水为流动相、流动相流速为1 ml/min条件下,纤维二糖、纤维三糖、纤维四糖、纤维五糖的适宜检测条件为:流动相乙腈:水(v/v)=65:35,色谱柱温度为41℃.

(2)在流动相乙腈:水(v/v)=65:35,色谱柱温度为41℃条件下,峰高Y与浓度X的定量检测方程为:纤维二糖Y=3001X-147.6;纤维三糖Y=915.9X+411.6;纤维四糖Y=1328X+10002;纤维五糖Y=2029X-1357.

[1]毛丙永.功能性低聚糖对肠道细菌的影响及机制[D].无锡:江南大学,2015.

[2]张南南.功能性低聚糖的分离纯化和生理功能的研究[D].南京:南京林业大学,2012.

[3]武媛丽,杨本鹏,蔡文伟,等.利用高效液相色谱法测定转基因甘蔗中的低聚果糖[J].热带生物学报,2011,2(2):101-106.

[4]万鹏,赵贞,刘春霞,等.高效液相色谱法测定调制乳中低聚果糖的含量[J].乳业科学与技术,2015,38(3):23-25.

[5]张丽君.低聚果糖检测分析方法对比及优劣性分析[J].食品工业科技,2015,36(23):395-399.

[6]陈多谋,宋维春,徐云升.香蕉茎干粉制备工艺研究[J].琼州学院学报,2016,23(2):40-43.

[7]袁学军,王琼妹,方慧丽,等.灵芝孢子粉冲剂加工工艺的研究[J].琼州学院学报,2015,22(5):56-60.

[8]徐小雄,雷鸣,邵贵银,等.吊罗山阿宽蕉根际土壤放线菌的分离与初步鉴定[J].琼州学院学报,2014,21(5):58-63.

(编校：李由明)

The HPLC Determination of Cello-oligosaccharides

SONG Wei-chun, PEI Zhi-sheng, SUN Hong-yuan, LIANG Zhi-peng，LI Xin-yi, XU Yun-sheng

(School of Life Science and Ecology, Hainan Tropic Ocean University, Sanya Hainan 572022, China)

In this paper, the HPLC-RID determination conditions of cellobiose, cellotriose, cellotetraose and cellopentaose were explored with Inertsil NH2chromatographic column.The results showed that the appropriate HPLC conditions on the determination of cello-oligosaccharides are that the mobile phase is acetonitrile/water (v/v) = 65/35; the velocity of mobile phase, 1ml/min; column temperature, 41℃; and the sensitivity of detector, +8.Correlations of peak height(Y) and concentration(X) are Y=3001X-147.6 for cellobiose, Y=915.9X+411.6 for cellotriose, Y=1328X+10002 for cellotetraose, and Y=2029X-1357 for cellopentaose.

HPLC; cellobiose;cellotriose; cellotetraose;cellopentaose

格式：宋维春,裴志胜,孙宏元,等.HPLC法测定纤维低聚糖的研究[J].海南热带海洋学院学报,2017，24(2)：70-73.

2017-02-22

国家自然科学基金项目(21262026)

宋维春(1965-),女,辽宁辽阳人,海南热带海洋学院生命科学与生态学院教授,硕士,研究方向为食品化学.

徐云升(1963-),男,辽宁辽阳人,海南热带海洋学院生命科学与生态学院教授,硕士,研究方向为食品科学.

O629.1；TS20

A

2096-3122(2017) 02-0070-04

10.13307/j.issn.2096-3122.2017.02.14