郑珍容 贺斌峰 魏征华 王关嵩 戢福云 徐智



·论著·

脂多糖/脂多糖结合蛋白复合物的初步构建

郑珍容 贺斌峰 魏征华 王关嵩 戢福云 徐智

目的采用温孵法构建脂多糖/脂多糖结合蛋白(LPS/LBP)复合物，研究LPS炎症信号通路。方法将LPS与LBP按 15︰1、10︰1、5︰1的比例混匀。把LPS/LBP混合物、LBP(浓度分别为200 μg/ml、100 μg/ml和50 μg/ml)、LPS(浓度分别为100 μg/ml、50 μg/ml)过夜孵育。将孵育后的LPS/LBP混合物、LBP、LPS行凝胶电泳，经考马斯亮蓝染色后将各染色条带切取，行蛋白回收，并测定内毒素。结果凝胶电泳后，LPS/LBP复合物、LBP泳道于相对分子质量52×103处可见考马斯亮兰染色的条带。样本中LBP浓度越高、条带染色越浓，LPS泳道对应于相对分子质量52×103处无染色条带出现。各浓度比例的LPS/LBP复合物电泳后凝胶条带回收物中均能检测出内毒素。10︰1 LPS/LBP复合物组、15︰1 LPS/LBP复合物组复合物内毒素浓度显著高于5︰1 LPS/LBP复合物组内毒素浓度(P<0.05)。10︰1 LPS/LBP复合物组与15︰1 LPS/LBP复合物组内毒素浓度无统计学差异(P>0.1)。各浓度LBP组均未检出内毒素，各LPS组内毒素检测也为阴性。 结论LPS︰LBP为10︰1是较为合理的构建LPS/LBP复合物的比例，通过温孵及凝胶电泳可获得纯度较高的LPS/LBP复合物。

脂多糖； 脂多糖结合蛋白； 复合物； 构建

脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)又称为内毒素，是革兰阴性细菌外壁的主要成分,是内毒素性急性肺损伤(acute lung injury, ALI)主要致病因素之一,可致内毒素性急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)[1-3]。脂多糖结合蛋白(lipopolysaccharide binding protein, LBP)是一种相对分子质量为60×103的糖蛋白,其蛋白质部分由一条相对分子质量5×103的单链多肽组成。LBP分子具有氨基(N)末端区域和羧基(C)末端区域。LPS致炎效应的增强需要有LBP的参与，LBP可以将LPS解聚为单体，单体形式的LPS在LBP的N末端参与下，将LPS递呈给位于单核巨噬细胞及中性粒细胞表面的受体CD14从而启动LPS炎症信号通路,诱发级联式炎症反应瀑布,导致ALI[4-8]。其中LPS/LBP/CD14三聚复合物形成后可以明显放大炎症反应，LBP/CD14系统在这一过程中起重要作用，所以又被称为内毒素增敏系统。当机体发生内毒素血症时，CD14主要与LPS/LBP复合物结合而启动炎症信号通路。因此，目前对CD14与LPS致炎作用相关的功能域的认识存在一定误区，即割裂看待LPS、LBP、CD14结合的问题。实际上，无论是CD14与LPS结合的功能域，还是CD14与LBP结合的功能域，均不能反映CD14与LPS致炎作用相关的实际功能域。目前针对CD14/LPS结合功能域或CD14/LBP结合功能域开发的各种拮抗剂均未能取得良好的临床抗内毒素作用也从一定程度上证实了这一问题。由此，推测CD14一定存在特异区域与LPS/LBP复合物结合的功能域，而这一功能域才是决定LPS启动致炎信号通路的关键点。寻找LPS/LBP复合物与CD14的结合位点，筛选该位点的抑制剂，有可能早期阻断LPS炎症信号通路。本实验构建LPS/LBP复合物，以期为内毒素性急性呼吸窘迫综合征提供防治策略。

材料与方法

一、实验材料

Rh LBP(sigma公司，美国)，LPS(sigma公司，美国)，蛋白marker(Thermo公司，美国)，其他试剂均为国产分析纯。电泳仪(BIO-RAD，美国)，凝胶显像仪(BIO-RAD ChemiDoc MP Imaging System，美国)，纯水仪(Millipore公司，美国)，恒温水浴箱(上海一恒公司),垂直电泳槽 (BIO-RAD，美国),内毒素检测设备(动态试管仪，LKL-164-03，英国)。

二、实验方法

1. 实验分组：实验共分为8组：15︰1 LPS/LBP复合物组(LPS︰LBP=3 000 μug/ml︰200 μg/ml)、10︰1 LPS/LBP复合物组(LPS︰LBP=1 000 μg/ml︰100 μg/ml)、5︰1 LPS/LBP复合物组(LPS︰LBP=250 μg/ml︰50 μg/ml)、200 μg/ml LBP组、100 μg/ml LBP组、50 μg/ml LBP组、100 μg/ml LPS组、50 μg/ml LPS组。

2. 复合物的孵育： 将LPS与LBP按3 000 μg/ml︰200 μg/ml、1 000 μg/ml︰100 μg/ml、250 μg/ml︰50 μg/ml的比例混匀。随后将LPS/LBP复合物、100 μg/ml LBP、100 μg/ml LPS置于恒温水浴摇床过夜孵育，170 r/min，孵育温度37 ℃，孵育时间为10 h。

3. 凝胶电泳及考马斯亮蓝染色与凝胶显像： 自来水清洗玻璃板，并室温晾干，将厚薄两块胶板对齐后装入制胶架上，配制10%分离胶及5%浓缩胶，注入分离胶及浓缩胶，将新鲜1×蛋白电泳缓冲液加入电泳装置的内槽至少漫过内侧矮玻璃板，外槽中倒入加入1×蛋白电泳缓冲液至所需的刻度指示处，按样品与缓冲液比例4︰1向各样品中加入上样缓冲液并混匀，用50 μl微量加样器加入样品，加样顺序为LPS/LBP复合物、LBP、LPS,加样体积均为20 μl，蛋白Marker点样孔加3 μl。正确接通正负电极，开通电源，选择110 V恒压下进行电泳1～1.5 h，直至Maker条带完全跑开，最小分子量条带迁移至分离胶下缘时停止电泳，取出电泳后的聚丙烯酰胺凝胶，用蒸馏水冲洗凝胶，考马斯亮蓝染色30 min，将胶放入另一个干净的器皿中用双蒸水冲洗胶，再加入20 ml一倍的脱色液，置于摇床上，震荡清洗15 min，重复3次。清洗后，进行蛋白条带的观察并将凝胶置于凝胶显像仪上显像。

4. 条带内容物回收： 显像后切取凝胶上的LPS/LBP复合物条带、LBP条带、LPS条带，用PAGE胶蛋白微量回收试剂盒回收LPS/LBP复合物、LBP和LPS凝胶条带。参照PAGE胶蛋白回收试剂盒说明书回收各条带内容物。

5. 内毒素测定： 用二喹啉甲酸法(bicinchonininc acid, BCA)检测各组回收物的蛋白浓度，并将其调成一致(LPS组不含蛋白，不进行蛋白浓度调整)，送第三军医大学第一附属医院内毒素检测中心进行测定。

三、统计学方法

结 果

一、LPS/LBP复合物与LBP、LPS电泳

经凝胶显像仪显像，LPS/LBP复合物、LBP泳道于相对分子质量52×103处可见考马斯亮兰染色的条带。样本中LBP浓度越高、条带染色越浓。而LPS泳道对应于相对分子质量52×103处无染色条带出现，这与样本中不含蛋白质有关，见图1。

图1 LPS/LBP复合物、LBP和LPS的凝胶显像结果；注：泳道1：3 000 μg/ml︰200 μg/ml LPS/LBP；泳道2：1 000 μg/ml︰100 μg/ml LPS/LBP；泳道3：250 μg/ml︰50 μg/ml LPS/LBP；泳道4：200 μg/ml LBP；泳道5：100 μg/ml LBP；泳道6：50 μg/ml LBP；泳道7：200 μg/ml LPS；泳道8：100 μg/ml LPS

二、凝胶回收物内毒素测定

各浓度比例的LPS/LBP复合物电泳后凝胶条带回收物中均能检测出内毒素。10︰1 LPS/LBP复合物组、15︰1 LPS/LBP复合物组复合物内毒素浓度显著高于5︰1 LPS/LBP复合物组内毒素浓度(P<0.05)。10︰1 LPS/LBP复合物组与15︰1 LPS/LBP复合物组内毒素浓度无统计学差异(P>0.1)。各浓度LBP组均未检出内毒素，LPS组内毒素检测也为阴性，见表1，图2。

表1 LPS/LBP复合物组凝胶回收物内毒素水平

注：aP<0.05，与5︰1LPS/LBP组比较

图2 各实验组凝胶回收物内毒素水平；aP<0.05，与5︰1LPS/LBP组比较；各LBP组、LPS组内毒素测定均为阴性

讨 论

内毒素是革兰阴性菌细胞壁中的LPS组分，LPS的主要毒力部分是类脂A，与O特异性多糖和非特异性多糖共同组成LPS,革兰阴性菌死亡后可裂解释放LPS并进入血循环[9-12]。LPS由于是两性分子，在水环境中形成高于临界胶束浓度的多聚体。LPS进入血循环以多聚体的形式存在，对组织器官没有直接损伤作用。LBP是由肝脏合成的急性期蛋白，是一种相对分子质量为60×103的糖蛋白，革兰阴性杆菌感染后被释放到血液中,能增强单核细胞和粒细胞对LPS的敏感性[13-14]。人LBP蛋白质是由26个氨基酸残基的疏水性多肽片段和一个456个氨基酸残基组成的蛋白质多肽链。LBP分子具有氨基(N)末端区域和羧基(C)末端区域，LPS多聚体需在LBP的N末端的参与下解聚为单体并形成LPS/LBP复合物后才能与单核-巨噬细胞等炎症效应细胞上的CD14结合，形成LPS/LBP/CD14三元复合物，从而启动LPS炎症信号通路[15-19]。因此，理想的研究策略应是封闭CD14上与LPS/LBP复合物结合的功能域，让LPS/LBP复合物不能与CD14结合而启动LPS炎性通路，又可通过肝脏细胞吞噬、清除，甚至还保留了LBP调理巨噬细胞、中性粒细胞等对LPS进行吞噬清除的效应。以往的研究存在孤立考虑LBP与CD14结合的问题，因此推测CD14具有特异地与LPS/LBP复合物结合的功能域，寻找这一特殊的功能域，可能找到一种更为有效的拮抗内毒素的治疗方法。因此，在研究CD14与LPS/LBP复合物结合的功能域时，需要获得纯度较高的LPS/LBP复合物。而目前并无商品化的复合物出售。本研究采用温孵法、电泳分离法及胶回收法构建LPS/LBP复合物，结果表明初步获得了可用于研究的LPS/LBP复合物。

构建LPS/LBP复合物涉及以下LPS与LBP几个问题：①LPS与LBP应该以多少比例混匀孵育；②如何分离LPS与LBP混合物中游离的LPS和LBP，获得相对纯化的LPS/LBP复合物；③如何回收LPS/LBP复合物，并鉴定LPS已与LBP结合。由于目前关于LBP与LPS的结合比例尚无明确的数据，针对这些问题设计实验。因此设计了LPS︰LBP分别为15︰1、10︰1及5︰1三个梯度比例组，目的是为了保证LPS对LBP处于相对饱和的浓度，并探索最佳的LPS与LBP结合比例。由于不能确定最佳的LPS与LBP比例，并且温孵过程中存在一些不可控的因素，即使LPS︰LBP按最佳比例混匀，仍会有少量游离的LPS和LBP存在于混合物中。为获得纯度较高的LPS/LBP复合物。对LPS/LBP混合物进行了聚丙烯酰胺凝胶电泳。同时设置了单纯的LBP组和LPS组作为对照。

聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种常用的蛋白质分析技术[20]。十二烷基硫酸钠-聚丙稀醜胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)法经过多次改进,在蛋白质分离、鉴别、纯化等方面的优越性逐渐显示出来[21]。SDS是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠。而强还原剂如巯基乙醇，二硫苏糖醇能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂。在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白- SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异,从而使蛋白样品在电场中迁移[22-26]。LPS/LBP混合物中的LBP为蛋白质，可以在凝胶电泳中迁移，并大约在相对分子质量51×103处形成电泳条带。而LPS的主要成分是多糖，且其相对分子质量仅为1×103左右。一方面其在凝胶中不能像蛋白质一样迁移，另一方面即使能形成电泳条带，也会距相对分子质量52×103处较远。因此通过这一方法可有效地去除LPS/LBP混合物中游离的LPS。

虽然聚丙烯酰胺凝胶电泳能够有效去除LPS/LBP混合物中游离的LPS，但这一方法并不能去除LPS/LBP混合物中游离的LBP。为了尽量减少LPS/LBP混合物中游离的LBP，本实验设计了LPS︰LBP分别为15︰1、10︰1及5︰1三个梯度比例组。而研究结果也表明，LPS︰LBP为15︰1和10︰1两组经凝胶电泳回收后检测的内毒素浓度显著高于LPS︰LBP为5︰1这一组。并且LPS︰LBP为15︰1和10︰1两组间的内毒素浓度无显著差异。以上结果表明，当LPS︰LBP为5︰1时尚有部分LBP未与LPS结合；当LPS︰LBP为10︰1时LBP能充分与LPS结合；而 LPS︰LBP 为15︰1时复合物中LPS浓度未显著提高也证明LPS︰LBP为10︰1是较为合理的构建LPS/LBP复合物的比例。

为了排除经凝胶电泳回收后的各条带中检测到的内毒素不是由游离内毒素在凝胶电泳过程中自由弥散所致的污染。本实验同时切取了单独的LBP组及相对分子质量52×103水平处的LPS泳道上的凝胶，回收后检测内毒素。结果表明，无论是LBP组还是LPS组，其回收的凝胶条带内均未检测到内毒素。这一结果进一步确证LPS/LBP复合物中的内毒素确与LBP相结合。

综上所述，本研究结果表明采用LPS︰LBP为10︰1是较为合理的构建LPS/LBP复合物的比例，这一比例可尽量减少了LPS/LBP复合物中的游离LBP。聚丙烯酰胺凝胶电泳能够有效去除LPS/LBP混合物中游离的LPS，获得纯度较高的LPS/LBP复合物。通过以上方法，本实验初步构建了较高纯度的LPS/LBP复合物，为进一步探索CD14在内毒素性应答中的相关功能域，筛选该位点的抑制剂，为早期防治内毒性ARDS提供了防治策略。

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(本文编辑：黄红稷)

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Preliminary constructing of lipopolysaccharide/lipopolysaccharide complexes

ZhengZhenrong,HeBinfeng,WeiZhenghua,WangGuansong,JiFuyun,XuZhi.

InstituteofRespiratoryDiseases,KeyLaboratoryofRespiratoryDiseasesResearch,XinqiaoHospital,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400037,China

XuZhi,Email:xuzhi201211@163.com

Objective To construct lipopolysaccharide/lipopolysaccharide binding protein(LPS/LBP) complexes by incubation for further study of LPS inflammatory signaling pathway. Methods LPS and LBP were mixed at following ratio: 15︰1, 10︰1 and 5︰1. The LPS/LBP mixtures, LBP (200 μg/ml, 100 μg/ml, 50 μg/ml) and LPS (100 μg/ml, 50 μg/ml) were incubated in constant temperature shaker overnight. The LPS/LBP mixtures, LBP and LPS were separate by gel electrophoresis. All the bands were harvested after coomassie blue staining for protein recovery, and endotoxin test. Results At relative molecular mass 52×103, LPS/LBP mixture groups and LBP groups appeared Coomassie blue staining bands, LPS groups didn′t show it. The higher concentration of LBP had the darker band . The endotoxin tests of all LPS/LBP mixture groups were positive. The endotoxin concentration of 15︰1 and 10︰1 LPS/LBP mixture groups were significantly higher than that of 5︰1 LPS/LBP mixture group(P<0.05). There was no significant difference between the endotoxin concentrations of 15︰1 and 10︰1 LPS/LBP mixture groups(P>0.1). The endotoxin tests of all LBP groups were negative. LPS groups aslo showed negative results for endotoxin test. Conclusions The ideal ratio of LPS︰LBP to construct LPS/LBP complex is 10︰1. Purified LPS/LBP complex can be obtained by incubation and gel electrophoresis.

Lipopolysaccharide; Lipopolysaccharide binding protein; Complexes; Construction

10.3877/cma.j.issn.1674-6902.2017.02.012

国家自然科学基金资助项目(81370169)

400037 重庆，第三军医大学新桥医院呼吸内科 全军呼吸内科研究所 全军呼吸病研究重点实验室

徐智， Email: xuzhi201211@163.com

Q503，Q513

A

2017-03-09)