刘俊彦 吕学军 赵维 胡明冬 李玉英 王关嵩 徐剑诚 钱桂生



·论著·

基因芯片筛选Sirt1在小鼠急性呼吸窘迫综合征炎症损伤中相互作用的基因

刘俊彦 吕学军 赵维 胡明冬 李玉英 王关嵩 徐剑诚 钱桂生

目的筛选小鼠急性呼吸窘迫综合征炎症损伤中与Sirt1相互作用的基因，探讨Sirt1在急性呼吸窘迫综合征炎症反应中的作用机制。方法购买Sirt1过表达(Tg)小鼠和野生型(WT)小鼠，饲养、繁殖、鉴定新生小鼠基因型；Western Blot鉴定小鼠肺组织Sirt1表达差异；建立ARDS小鼠模型，观察ARDS小鼠肺组织HE染色病理变化，并采用ELISA检测两种ARDS小鼠肺组织IL-6表达差异；采用基因芯片筛选Sirt1在小鼠ARDS炎症损伤中相互作用的基因。结果通过聚合酶链反应鉴定出Tg和WT两种不同基因型的小鼠；免疫印迹法检测小鼠肺组织Sirt1的表达差异结果提示Tg小鼠肺组织Sirt1含量显著高于WT小鼠(P=0.001)；不同浓度LPS腹腔注射12 h后小鼠肺组织HE染色病理变化提示随着LPS用量增加，两种小鼠肺组织损伤程度明显增加，且WT-ARDS小鼠的肺组织损伤程度比Tg-ARDS小鼠更为严重；当LPS用量达到20 mg/kg时两组小鼠存活率<50%；两种小鼠腹腔注射LPS(15 mg/kg)后，肺组织IL-6的表达随时间推移逐渐呈现逐渐增高的趋势，在3，6，12，24 h WT-ARDS组肺组织IL-6表达浓度显著高于Tg-ARDS组(P<0.05)，尤其在12 h差异最为显著(P=0.007)。基因芯片筛选出在小鼠ARDS炎症损伤中与Sirt1相互作用的基因有Ubd，Ube2d2b，Olfm4，Il1rl1，Hivep3和Lpar1。结论Sirt1可能通过调控Ubd，Ube2d2b，Olfm4，Il1rl1，Hivep3和Lpar1的表达减轻ARDS小鼠的炎症损伤。

急性呼吸窘迫综合征； 沉默信息调节因子1； 泛素D； 核转录因子κB

Sirtuins是第三类组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases, HDACs)，其分布广泛，底物众多，作用机制复杂。哺乳动物Sirt1(Sirtuin type 1)是酵母沉默信息调节因子2(Sir2)的同源基因，其功能的发挥依赖NAD+[1]。核定位的Sirt1因其能去乙酰化组蛋白，从而具有调控多种关键的生理和病理过程，以及多种疾病发生发展的能力。研究发现乙酰白藜芦醇(AC-Res，Sirt1激活剂)预处理能使急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)小鼠的炎症反应减轻[2]，因此有学者将Sirt1定义为ARDS炎症反应的关键分子之一[3]，但Sirt1参与ARDS发生发展的机制目前仍未阐明，Sirt1在小鼠ARDS中相互作用的分子也未有较全面的报道。本实验通过对两种不同Sirt1基因的ARDS小鼠肺组织基因芯片进行分析，筛选小鼠ARDS中与Sirt1相互作用的基因。

材料和方法

一、研究材料

实验动物 从美国Jackson实验室购入Sirt1superB6.Cg-Tg(Sirt1)ASrn/J小鼠(简称Tg小鼠)雄鼠2只和野生型(WT)雌性小鼠2只。小鼠饲养在第三军医大学新桥医院动物中心，按照雌雄1︰1繁殖，室内恒温25 ℃，照明12 h昼夜交替，喂食饲料制备于第三军医大学动物中心，子代小鼠21 d断乳分笼，待8周龄后继续近亲繁殖。

二、主要设备和试剂

SDS-PAGE电泳设备，PCR仪，水平电泳仪，Thermo紫外分光光度计，TIANGEN快速DNA提取扩增套装，Trizol、RIPA强裂解液、BCA蛋白浓度检测试剂盒、Trisbase、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、LPS均来自Biosharp公司，Anti-SIRT1抗体(Abcam公司)，Actin β Polyclonal Antibody(ruiying biological公司)，小鼠IL-6 ELISA检测试剂盒(QuantiCyto)，Agilent mRNA 单通道表达谱芯片。

三、测定方法

1. 动物基因型鉴定

(1)小鼠基因组DNA提取对10～12 d 子代小鼠打耳标编号，并剪取0.5 cm尾巴进行鉴定。基因组DNA提取方法按照TIANGEN快速DNA提取扩增套装，紫外分光光度计进行DNA定量。

(2)聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)引物来自Jackson实验室官网，Tg小鼠标记(350 bp)F：5′-AGA TAG TTC ACC GGG GTG AGA-3′；Tg-R：5′-TCG GTC GAA GAG TAT CTG GTG-3′。内参(200 bp)F：5′-CAA ATG TTG CTT GTC TGG TG-3′；内参R：5′-GTC AGT CGA GTG CAC AGT TT-3′。反应体系25 μl。扩增条件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃ 10 min；4 ℃ 保温。

2. Western blot鉴定小鼠Sirt1表达: 8～12周龄小鼠，无菌条件下取出肺组织，按照RIPA强裂解液提供方法抽提肺组织蛋白，BCA蛋白浓度测定法测定蛋白浓度。加入5*蛋白上样缓冲液，沸水变性5 min。SDS-PAGE电泳和显影：兔抗鼠Sirt1抗体(1︰500)或兔抗鼠β-actin抗体(1︰1 000)；山羊抗兔抗体(1︰1 000)。

3. ARDS小鼠模型的建立

(1) ARDS小鼠肺组织HE染色病理变化差异：随机选取Tg和WT小鼠(8～12 W)各20只，各随机分为5组，分别腹腔注射LPS(0 mg/kg)，LPS(5 mg/kg)，LPS(10 mg/kg)，LPS(15 mg/kg)，LPS(20 mg/kg)[4]，自由进食水，12 h后无菌条件下取出肺组织，用4%多聚甲醛固定72 h，常规制备石蜡切片，带HE染色。

(2) ELISA检测两种ARDS小鼠肺组织IL-6表达差异：随机选取Tg和WT小鼠(8～12 W)各15只，腹腔注射LPS(15 mg/kg)，分别在0、3、6、12、24 h各处死小鼠3只，取肺组织100 μg，加入1 ml PBS，冰上匀浆10 s，4 ℃，以离心半径8 cm，3 000 r/min离心10 min取上清。按照QuantiCyto小鼠IL-6 ELISA试剂盒说明检测不同时间点小鼠肺组织IL-6的表达水平。

4. 基因芯片筛选Sirt1在小鼠ARDS中相互作用的基因[5]: 根据以上实验结果，随机选取Tg和WT小鼠(8～12 w)各10只，各随机分为2组，实验组腹腔注射LPS(15 mg/kg)对照组生理盐水处理，自由进食水，12 h后无菌条件下取出肺组织，Trizol法提取肺组织mRNA，-80 ℃保存。Agilent mRNA 单通道表达谱芯片检测，由北京博奥公司提供检测服务。

三、统计学方法

结 果

一、基因型鉴定

经过繁殖、基因型鉴定筛选出Tg小鼠和WT小鼠，1，2，5，6表达350 bp条带和200 bp条带，为Tg小鼠；3，4，7，8只表达200 bp条带，为WT小鼠，见图1。

二、小鼠Sirt1表达检测

免疫印迹法检测两种不同Sirt1基因背景的小鼠肺组织Sirt1的含量，Tg小鼠肺组织Sirt1表达水平显著高于WT小鼠(P=0.001)，见图2。

三、ARDS小鼠模型

1. ARDS小鼠肺组织HE染色病理变化： ARDS小鼠肺组织HE染色观察不同浓度LPS腹腔注射12小时后肺组织的病理形态，见图3，当LPS用量从5 mg/kg经10 mg/kg增加到15 mg/kg时，两种小鼠肺组织损伤程度明显增加，镜下表现为肺组织弥漫性出血、肺泡腔内红细胞漏出、肺泡间隔破坏增宽、肺组织内中性粒细胞浸润均不同程度增加，且Tg-ARDS小鼠的肺组织损伤程度比WT-ARDS小鼠轻；LPS(20 mg/kg)两组小鼠存活率<50%，未做进一步分析。

2. ARDS小鼠肺组织IL-6表达: 小鼠LPS 15 mg/kg腹腔注射，分别在不同的时间点检测小鼠肺组织IL-6的表达差异，见图4，两种ARDS小鼠肺组织IL-6的表达随时间推移逐渐增加，与0 h对比均差异显著(P<0.01)；两种对照组小鼠(0 h)肺组织IL-6浓度差异无统计学意义(P=0.239)，在3、6、12、24 h WT-ARDS组肺组织IL-6浓度显著高于Tg-ARDS组(P<0.05)，尤其在12 h最为显著(P=0.007)。

图1 小鼠基因鉴定

图2 小鼠肺组织Sirt1表达

图4 两种ARDS小鼠肺组织IL-6表达变化

四、基因芯片筛选Sirt1在小鼠ARDS中相互作用的基因

通过对基因芯片的数据聚类分析WT-ARDS：WT-Control表达差异显著的炎症相关基因有1 000余个，经与WT-ARDS： Tg-ARDS所得结果交叉对比

图3 不同浓度LPS腹腔注射12 h后小鼠肺组织以病理变化(HE×20)

和查阅文献共得到6个在小鼠ARDS中与Sirt1相互作用的基因，见表1。其中促炎基因4个，分别为Ubd，Ube2d2b，Olfm4，Il1rl1，WT-ARDS：Tg-ARDS上述4个基因表达上调；抗炎基因2个，为Hivep3和Lpar1，WT-ARDS：Tg-ARDS上述两个基因表达下调，具体差异倍数见表1“FC (abs) WT-ARDS：Tg-ARDS”列。

表1 小鼠ARDS炎症损伤中与Sirt1相互作用的基因

讨 论

ARDS是由肺内外各种致病因素引起的，以顽固性低氧血症为特征的临床综合征[5-6]。ARDS病因繁多，不同病因所致急性呼吸窘迫综合征发病机制也各有不同，其中肺炎是引起直接肺损伤的最常见原因[7-8]，而不可控的肺内炎症、内皮和上皮细胞损伤是ARDS 发生发展的重要部分[9]。细菌脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)是参与重症肺炎患者进展为ARDS的重要分子，也是实验中常用制备ARDS动物模型的试剂[10]。Sirt1广泛分布于人体各种组织器官，参与炎症、细胞凋亡/增殖、细胞分化/衰老、新陈代谢和细胞周期调控等多种生理病理过程[11]。组织病理学提示AC-Res处理显著减少中性粒细胞从血管到肺泡的渗漏，而AC-Res除了调节炎性细胞因子的表达外，还影响参与炎症发病机制的酶和介质的活化[12]。但Sirt1参与ARDS发生发展的机制目前仍待探索，Sirt1在小鼠ARDS中相互作用的分子也未有较全面的报道。

本实验所用Sirt1过表达转基因小鼠来自Jackson实验室[13]。实验发现两种小鼠在经不同剂量的LPS腹腔注射12 h后，Tg小鼠的肺组织损伤程度均较WT小鼠轻；且LPS 15 mg/kg腹腔注射12 h后，T g小鼠炎症因子IL-6的表达水平也明显低于WT小鼠。证明Sirt1能减轻ARDS小鼠的炎症反应。通过对基因芯片的数据聚类分析和查阅文献共得到6个在小鼠ARDS中与Sirt1相互作用的基因。其中促炎基因4个，分别为Ubd，Ube2d2b，Olfm4，Il1rl1，WT-ARDS：Tg-ARDS以上4个基因表达上调，即这些基因在WT-ARDS中的表达高于Tg-ARDS；其中抗炎基因2个，为Hivep3和Lpar1，WT-ARDS：Tg-ARDS以上2个基因表达下调，即这些基因在WT-ARDS中的表达低于Tg-ARDS。泛素D(ubiquitin D, Ubd)、泛素偶联酶E2D2B(ubiquitin-conjugating enzyme E2D2B, Ube2d2b)、嗅觉素-4(olfactomedin-4, Olfm4)、白细胞介素-1受体1(interleukin-1 receptor-like 1, Il1rl1)、转录因子HIVEP3(transcription factor HIVEP3)均与NF-κB通路密切相关：Ubd通过促进蛋白酶体降解泛素化的IκBα，参与调控LPS介导的NF-κB的活化[14-15]；Ube2d2b参与NFκBIα的降解；Olfm4通过NOD1和NOD2介导的NF-κB激活和随后的细胞因子和趋化因子产生在幽门螺杆菌感染的宿主防御中发挥重要作用[16]；NF-κB参与调节粒细胞集落刺激因子引起的Olfm4的表达，在早期骨髓发育中起重要作用[17]。Il1rl1是IL-33的受体，IL-33是一种促炎症因子，可以通过细胞膜表面的ST2及相关信号传导蛋白Acp受体复合物，将活化信号传递到胞内，经过一系列的信号传递，激活NF-κB[18]和MAPK等，诱导效应因子IL-5等的释放，起到调节免疫应答等的功能；此外IL-33能激活巨噬细胞，增加气道炎症反应[19]。HIVEP3抑制TNF-α诱导的NF-κB激活作用显著，能通过多种机制干预NF-κB[20-21]：作为一种转录因子，通过抑制 KκB基团抑制核转录；通过非转录途径-通过与TRAF2(一种肿瘤坏死因子信号转导中的适配分子)协作抑制RELA的核异位，阻断IKK复合体的形成。溶血磷脂酸受体1(lysophosphatidic acid receptor 1, Lpar1)是溶血磷脂酸 (LPA)的受体，LPA通过诱导趋化因子和脂质介质的释放在肺炎症中起重要作用。研究发现LPA能诱导肺上皮细胞中白细胞介素-8和前列腺素E2的分泌；LPA1的敲除或活性抑制对LPS诱导的肺部炎症有着显著的保护作用[22]。因此，Sirt1可能是通过下调ARDS小鼠炎症损伤中促炎基因Ubd，Ube2d2b，Olfm4，Il1rl1的表达和上调抗炎基因Hivep3和Lpar1的表达发挥炎症调节作用，从而减轻ARDS小鼠的炎症损伤。

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(本文编辑：王亚南)

刘俊彦，吕学军，赵维，等. 基因芯片筛选Sirt1在小鼠急性呼吸窘迫综合征炎症损伤中相互作用的基因[J/CD]. 中华肺部疾病杂志(电子版)， 2017， 10(2)： 168-172.

Screening of genes interacting with Sirt1 in inflammatory injury of acute respiratory distress syndrome in mice by gene chip

LiuJunyan,LyuXuejun,ZhaoWei,HuMingdong,LiYuying,WangGuansong,XuJiancheng,QianGuisheng.

Departmentofrespiratorymedicine,XinQiaoHospital,theThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400037,China

LiYuying,Email:lzhlyyhy@163.com

Objective To Screen of Sirt1 interacting genes in acute respiratory distress syndrome in mice by gene chip, and to provide a reference for exploring the mechanism of action of Sirt1 in acute respiratory distress syndrome. Methods Sirt1 overexpression (Tg) mice and wild type (WT) mice were bought for research, and the genotypes of newborn mice were identified after reproduction. The Sirt1 expression differences in lung tissue of Tg mice and WT mice were test by Western Blot. Construction of ARDS mouse model, the expression of IL-6 in lung tissue of two ARDS mice was detected by ELISA, and pathological changes in lung tissue of ARDS mice by HE staining were observed. Screening of Sirt1 interacting genes in acute respiratory distress syndrome in mice by gene chip. Results Two different genotypes of Tg and WT were identified by polymerase chain reaction (PCR). The expression of Sirt1 in lung tissue of mice which detecting by Western blot suggested that the Sirt1 in lung tissue of Tg mice was significantly higher than that of WT mice (P=0.001). Pathological changes of lung tissue of mice after intraperitoneal injection of LPS after LPS via HE staining prompted that with the increase of LPS dosage, the injury degree of lung tissue of two kinds of mice increased obviously, and the degree of lung injury in WT-ARDS mice was more serious than that of Tg-ARDS mice,and when the dosage of LPS reached 20 mg/kg, the survival rate of the two groups was <50%. Two kind of mice were injected intraperitoneally with LPS (15 mg/kg), The expression of IL-6 in lung tissue gradually increased with the passage of time,The expression of IL-6 in lung tissue of 3 h, 6 h,12 h, 24 h inWT-ARDS group was significantly higher than that in Tg-ARDS group(P<0.05), morever, the difference was the most significant especially in 12 h(P=0.007).Ubd, Ube2d2b, Olfm4, Il1rl1, Hivep3 and Lpar1 were identified as genes that interact with Sirt1 in mouse ARDS inflammatory lesions by gene chip screening. Conclusion Sirt1 may reduce the inflammatory damage in ARDS mice by regulating the expression of Ubd, Ube2d2b, Olfm4, Il1rl1, Hivep3 and Lpar1.

Acute respiratory distress syndrome; Sirtuin type 1; Ubiquitin D; Nuclear factor kappa B

10.3877/cma.j.issn.1674-6902.2017.02.011

国家自然科学基金面上项目(30770950)

400037 重庆，第三军医大学新桥医院呼吸内科

李玉英， Email：zhlyyhy@163.com

R563

A

2017-02-08)